网站开发适合什么工作,自适应网页模板制作教程,专业制作标书公司哪家好一点,建设网站收取广告费用小罗碎碎念 本期这篇文章#xff0c;我去年分享过一次。当时发表在知乎上#xff0c;没有标记参考文献#xff0c;配图的清晰度也不够#xff0c;并且分析的还不透彻#xff0c;所以趁着国庆假期重新分析一下。 这篇文章的标题为《Computerized tertiary lymphoid structu…小罗碎碎念 本期这篇文章我去年分享过一次。当时发表在知乎上没有标记参考文献配图的清晰度也不够并且分析的还不透彻所以趁着国庆假期重新分析一下。 这篇文章的标题为《Computerized tertiary lymphoid structures density on HE-images is a prognostic biomarker in resectable lung adenocarcinoma》作者包括Yumeng Wang, Huan Lin, Ningning Yao等。 一作通讯 作者类型作者姓名单位名称单位地址第一作者Yumeng Wang桂林电子科技大学计算机科学与信息安全学院桂林 541004, 中国通讯作者Xipeng Pan桂林电子科技大学计算机科学与信息安全学院桂林 541004, 中国通讯作者Cheng Lu广东省人民医院放射科/南方医科大学广州 510080, 中国通讯作者Jun Liu中南大学湘雅二医院放射科长沙 410011, 中国通讯作者Zhenbing Liu桂林电子科技大学计算机科学与信息安全学院桂林 541004, 中国通讯作者Zaiyi Liu广东省人民医院放射科/南方医科大学广州 510080, 中国 文献速览
研究背景和目的
肺腺癌LUAD是非小细胞肺癌最常见的亚型具有高发病率和死亡率。组织中的三级淋巴结构TLS数量增加与肺腺癌患者的有利预后相关。手动评估TLS是经验依赖和耗时的过程限制了其临床应用。 研究内容和发现
开发了一种自动化计算工作流程用于量化常规苏木精-伊红HE染色的全切片图像WSIs中肿瘤区域的TLS密度。在三个独立数据集中的802名可切除LUAD患者中进一步探索了计算机化的TLS密度与无病生存期DFS之间的关联。建立了结合临床病理变量和TLS密度的Cox比例风险回归模型以评估其预后能力。计算机化的TLS密度是可切除LUAD患者的独立预后生物标志物。将TLS密度与临床病理变量整合可以通过改善预后分层来支持个体化的临床决策。 研究方法
收集了1196名可切除LUAD患者的数据最终802名患者符合纳入和排除标准。使用最大选择排名统计方法确定TLS密度的截止值。通过Kaplan-Meier曲线展示了TLS密度低组与TLS密度高组在DFS方面的显著差异。通过多变量逐步Cox回归分析确定了TLS密度是DFS的独立预后因素。 结论
TLS密度的量化是一个可靠、可重复、具有普遍性的独立预后生物标志物。将TLS密度与临床病理变量整合可以改善患者分层指导个体化临床决策。 一、引言 肺腺癌LUAD是肺癌最常见的亚型具有较高的发病率和死亡率1。 对LUAD患者进行精确分层有助于个性化临床决策。肿瘤-淋巴结-转移TNM分期系统2在LUAD患者的风险分层和管理中起着关键作用但由于肿瘤异质性相同TNM分期的LUAD患者预后可能存在显著差异1,3。
近期研究发现三级淋巴结构TLSs4–6在抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用7,8。TLSs数量的增加与多种癌症类型包括黑色素瘤9、肺癌10和胃肠癌11等较好的预后相关。因此TLSs有望成为LUAD的补充预后生物标志物。
以往大多数研究通过多重免疫组化mIHC或免疫荧光mIF方法12–14对TLS相关指标进行定量分析。然而mIHC和mIF并非常规检查成本较高限制了其临床应用。相比之下苏木精-伊红HE染色是组织病理学中最广泛使用的染色技术。
HE染色的组织病理学切片成本低廉易于获取。图1展示了肿瘤内TLSs在HE染色切片上的代表性图像。因此在HE染色切片中评估TLSs可能更容易推广至临床实践。 图1展示了肿瘤区域内三级淋巴结构TLS的实例图像。 具体分析如下 图A 展示了不成熟的TLS呈现为密集的圆形或椭圆形的淋巴细胞团蓝色箭头100倍放大刻度条200微米。这表明在肿瘤区域中不成熟的TLS由紧密堆积的淋巴细胞构成。 图B 为图A中左下角一个不成熟TLS的更高放大倍数的图像红色箭头400倍放大与图A中的左下角不成熟TLS对应刻度条50微米。在更高放大倍数下可以更清晰地观察到TLS的细节如细胞的形态和排列。 图C 展示了成熟的TLS具有生发中心蓝色箭头100倍放大刻度条200微米。成熟的TLS通常包含一个或多个生发中心这是B淋巴细胞增殖和分化的区域。 图D 为图C中一个成熟TLS的更高放大倍数的图像生发中心显示为淡色区域红色箭头400倍放大与图C中的中心成熟TLS对应刻度条50微米。在更高放大倍数下可以观察到生发中心的细微结构这些结构在肿瘤免疫反应中起着关键作用。
总的来说这些图像展示了肿瘤区域内TLS的不同成熟阶段从不成熟的淋巴细胞团到包含生发中心的成熟结构反映了肿瘤微环境中复杂的免疫状态。 已开发出几种方法15,16基于常规HE染色的全切片图像WSIs对TLSs进行定量。然而这些识别TLSs的方法仍由病理学家手动评估耗时且依赖经验重复性较差17。
随着计算机技术的快速发展18有望开发出一种自动化、标准化的工作流程用于高效、准确地评估LUAD常规HE染色WSIs中的TLSs。
在本研究中作者开发了一种自动化工作流程用于量化HE染色WSIs肿瘤区域中TLSs的密度并使用三个独立的可切除LUAD患者数据集评估了TLS密度的预后价值。
作者假设TLS密度是疾病无进展生存DFS的独立预后因素并将TLS密度与临床病理学变量结合将提高可切除LUAD患者的预后分层。 二、结果
2-1患者
本研究共收集了1196例可切除LUAD患者最终802例患者符合纳入和排除标准附加文件图S1。 其中来自广东省人民医院GDPH的322例患者组成发现集来自中南大学湘雅二医院的226例患者组成外部验证集V1来自山西省肿瘤医院的134例患者和来自云南省肿瘤医院的120例患者组成外部验证集V2。
发现集的中位随访时间为85.3(83.1–89.8)个月外部验证集V1为60.2(58.5–62.7)个月外部验证集V2为37.1(35.5–48.3)个月。三个数据集的基线临床病理学变量见表1。 除性别p 0.158和肿瘤部位p 0.055外三个数据集在所有纳入的临床病理学变量上均存在显著差异。 2-2分割结果与一致性分析
Bland-Altman图显示基于HE染色WSIs的自动TLS计数与病理学家手动TLS计数之间的一致性良好组内相关系数[ICC] 0.89495%CI0.821–0.938p 0.001图2A基于IHC染色WSIs的一致性同样良好ICC 0.90395%CI0.836–0.944p 0.001图2B。
图2展示了Bland-Altman分析图用于评估基于手动计数和自动计数的三级淋巴结构TLS数量之间的一致性。这种分析常用于评估两种测量方法的一致性或可比性。 以下是对图2的详细分析 图2(A) - 基于HE染色的全切片图像WSIs 红色实线表示手动计数和自动计数TLS数量之间差异的平均值均值差。如果这条线接近零说明两种方法的平均差异较小一致性较好。蓝色虚线表示95%的一致性限制95% LoA即上下界。这些界限表示了两种计数方法之间差异的可接受范围。如果大多数数据点落在这个范围内这表明两种方法在统计上是一致的。ICC内类相关系数提供了一个统计量来衡量两种方法之间的一致性。ICC值接近1表示非常高的一致性。 图2(B) - 基于IHC染色的全切片图像WSIs 与图2(A)类似这里也展示了基于免疫组化IHC染色WSIs的TLS手动计数与自动计数之间的Bland-Altman分析。红色实线和蓝色虚线的意义与图2(A)相同分别表示差异的均值和95% LoA。ICC同样用来衡量两种方法间的一致性。 分析结论 如果红色实线接近零并且大多数数据点落在蓝色虚线表示的95% LoA内这表明手动和自动TLS计数方法具有很好的一致性。ICC值越接近1表示两种方法之间的一致性越好。通常ICC值大于0.75被认为是良好的一致性大于0.9则表示非常高的一致性。
这种分析对于验证自动化图像分析工具的准确性和可靠性至关重要特别是在病理学诊断和生物标志物量化中。通过这种对比研究人员可以对自动化计数方法进行校准和验证以确保其在临床和研究中的有效应用。 附加文件图S2展示了HE染色WSIs上手动TLS标注和自动TLS分割的示例图像。在TLS识别中观察到良好的定性一致性。 2-3TLS密度的预后价值 通过最大选择等级统计方法在发现集中确定TLS密度的截止值为0.489 TLSs/mm²。 Kaplan-Meier曲线显示在发现集HR 0.6695%CI 0.44–0.98p 0.037图3A和两个外部验证集V10.600.39–0.93p 0.022V20.290.16–0.55p 0.0001图3B和3C中TLS低组与TLS高组相比DFS显著较差。 结合TLS密度和TNM分期后三个数据集中可切除LUAD患者的风险分层变得更加精细p 0.0001图3D–3F。 在图4A中小提琴图显示TLS高组肿瘤区域内的淋巴细胞密度显著高于TLS低组p 0.001。此外作者还观察到在三个数据集中低TLS密度与免疫荒漠表型显著相关p 0.001图4B。
图4展示了TLS密度与淋巴细胞密度、免疫表型的相关性以及预测模型的性能。 以下是对图4的详细分析
图4(A) - TLS密度与淋巴细胞密度的关系
比较比较了TLS高密度组和TLS低密度组在肿瘤区域内淋巴细胞密度的差异。结果TLS高密度组的淋巴细胞密度显著高于TLS低密度组p 0.001使用Wilcoxon秩和检验进行分析。意义这表明TLS密度较高的区域有更多的淋巴细胞浸润可能与更强的抗肿瘤免疫反应相关。
图4(B) - TLS密度与免疫表型的关系
分布展示了三个数据集中TLS密度在不同免疫表型immune phenotypes的分布情况。结果TLS密度较低与免疫荒漠immune-desert表型相关联p 0.001使用Cochran-Armitage趋势检验进行分析。意义免疫荒漠表型的肿瘤通常具有较差的免疫细胞浸润和较低的TLS密度这可能与不良的预后相关。
图4© - 预测模型的性能
iAUC展示了每个模型经过1000次自助法bootstrap后的集成曲线下面积integrated area under the curve。模型 临床模型Clinical model包括吸烟状况、分化程度、TNM分期和淋巴血管侵犯LVI。完整模型Full model在临床模型的基础上增加了TLS密度。 结果以箱线图形式展示了三个数据集中每个模型的iAUC值。意义iAUC值越接近1模型的预测性能越好。通过比较临床模型和完整模型的iAUC值可以评估TLS密度作为预后生物标志物对模型预测性能的贡献。
分析结论
TLS密度与淋巴细胞密度TLS密度高的肿瘤区域有更多的淋巴细胞浸润这可能与肿瘤的免疫活性有关。TLS密度与免疫表型TLS密度低的肿瘤更可能是免疫荒漠表型这可能与较差的预后相关。预测模型性能完整模型包含TLS密度相比于仅包含临床特征的模型可能具有更好的预测性能这表明TLS密度是一个有潜力的预后生物标志物。
这些发现强调了TLS密度在评估肿瘤免疫微环境中的重要性并可能有助于改善临床预后模型的预测准确性。 基于单变量分析的结果性别、吸烟状况、TNM分期、分化等级、内脏胸膜侵犯VPI、淋巴血管侵犯LVI、辅助化疗、免疫表型和TLS密度被用作后续多变量分析的候选因素。
在多变量逐步Cox回归分析中TLS密度在发现集HR 0.6195%CI 0.41–0.92p 0.017和两个外部验证集V10.600.37–0.95p 0.031V20.320.17–0.60p 0.001表2中被证明是DFS的独立预后因素。
此外在无逐步回归的多变量分析中对单变量分析中p值小于0.05的因素进行调整后表2。 三个数据集中TLS密度的p值仍然低于0.05进一步表明TLS密度是DFS的独立预后因素附加文件表S2。 在亚组分析中为了提高发现能力将三个数据集中的所有患者合并。对于早期I–II期或TNM I期LUAD患者TLS高组的DFS显著优于TLS低组p 0.001附加文件图S3A和S3B。 对于TNM I期和II期LUAD患者TLS低组预后较差的趋势仍然存在附加文件图S3C和S3D尽管没有发现统计学上的显著差异。 此外在大多数按临床病理学变量包括年龄、性别、吸烟状况、肿瘤部位、分化等级、VPI、LVI和辅助化疗分层的亚组中也观察到了类似的趋势附加文件图S4和S5除了按家族史、手术类型、表皮生长因子受体EGFR和间变性淋巴瘤激酶ALK分层的亚组。 2-4预测模型的开发与验证
基于发现集中逐步选择方法确定的独立预后因素即吸烟状况、分化等级、TNM分期、LVI和TLS密度表2建立了一个预测DFS的Cox模型全模型。
此外为了进行性能比较建立了另外四个参考模型包括TNM分期模型、TLS密度模型、TNM分期和TLS密度模型以及临床模型吸烟状况和分化等级和TNM分期和LVI。每个预测模型的编码、回归系数和估计的5年基线危险度总结在附加文件表S1中。 在三个数据集表3中评估了五个模型的性能。 全模型在发现集中比临床模型具有更好的判别和校准能力一致性指数[C指数] 0.716 vs. 0.702综合曲线下面积[iAUC] 0.702 vs. 0.690赤池信息准则[AIC] 1373.345 vs. 1377.481似然比检验[LRT] p 0.013图4C以及两个外部验证集V1C指数 0.710 vs. 0.694iAUC 0.691 vs. 0.674AIC 929.065 vs. 931.250V2C指数 0.697 vs. 0.681iAUC 0.694 vs. 0.678AIC 923.722 vs. 937.909。
同样TNM分期和TLS密度模型在三个数据集中与TNM分期模型相比也实现了更好的性能。
此外5年时的时间依赖性受试者操作特征ROC曲线和不同时间点的时间依赖性曲线下面积AUC曲线显示在附加文件图S6中。 在三个数据集的大多数时间点上全模型与临床模型相比展现出了更好的预测性能。 三、讨论
对于可切除的肺腺癌LUAD患者准确的预后预测可以指导临床决策并改善风险分层。三级淋巴结构TLSs已被证实具有重要的预后价值。
然而现有针对可切除LUAD中TLSs评估的方法缺乏客观、高效和准确的TLSs量化工作流程。因此在本项多中心研究中作者开发了一个自动化工作流程基于常规HE染色的Whole Slide ImagesWSIs访问肿瘤区域中TLSs的密度并在三个独立的可切除LUAD患者数据集中评估了TLS密度对预测无病生存DFS的预后价值。
作者发现TLS密度是可切除LUAD患者的独立预后因素并且将TLS密度与临床病理学变量结合可以改善可切除LUAD的预后分层。 TLSs在有效的抗肿瘤免疫中发挥关键作用。 现有证据表明TLSs的存在和密度较高与更好的预后相关。TLSs的预后价值已在几种实体肿瘤类型中得到评估。
例如Horeweg等人的研究发现子宫内膜癌患者中肿瘤内TLSs具有超越临床病理学和分子变量的强烈有利预后影响。Silina等人在人类肺鳞状细胞癌的肿瘤周围和肿瘤内区域分析了TLS的形成并确定TLS密度是未经治疗患者的独立预后标志物。
近期研究确定了TLSs在肝癌患者中的预后价值考虑了不同解剖亚区域肿瘤内和肿瘤周围区域和不同免疫类别的TLSs。然而大多数先前的研究使用手动和定性的方法评估TLSs。 基于手动评估的方法量化TLSs非常耗时且容易受到观察者间变异性的影响。
在本研究中作者综合参考了当前研究并量化了肿瘤区域中的TLS密度。与上述研究不同作者的研究开发了一个自动化管道以标准化的方式评估TLS密度。
在肿瘤分割阶段采用了迁移学习的方法使用公开可用的带注释的数据集预训练分割模型。预训练模型使用少量带注释的LUAD组织病理学图像进行微调。
在组织分割和分类阶段作者采用基于斑块级分类标签的弱监督方法对组织病理学图像进行语义分割。此外本研究中基于HE染色WSIs的手动TLS计数ICC 0.894p 0.001或基于IHC染色WSI的手动TLS计数ICC 0.903p 0.001与自动化TLS计数之间存在良好的一致性如图2和附加文件图S2所示。
因此与基于手动评估的方法相比自动化工作流程不仅可以减轻病理学家的注释工作量还可以提高可重复性和可靠性。 在大多数针对肺癌的研究中TLSs是基于多重免疫组化mIHC或多重免疫荧光mIF图像进行评估的这些方法在临床设置中并不常规使用。
在作者的研究中设计了一个基于LUAD常规HE染色WSIs的工作流程来评估TLSs这可能更容易促进临床应用。在肺癌的背景下目前只有有限的研究在开发TLSs检测和分析的自动化方法方面取得了进展。
Barmpoutis等人提出了一种自动识别和量化TLS的方法并通过椭圆模型对淋巴细胞进行分割。这个管道在临床应用中显示出巨大潜力但研究并未分析其用于风险分层的价值。
Kushnarev等人进行的初步研究设计了一个数字成像分析平台用于识别LUAD的HE染色WSIs上的TLSs并在独立队列中通过患者分层进行了总体生存分析。
相比之下作者在来自中国不同地区的三个独立数据集中验证了自动化工作流程中量化的TLS密度在预后能力上的价值。 作者发现在三个数据集中TLS密度是一个独立的预后因素尽管这些数据集在基线特征上存在统计学上的显著差异表1。
此外量化的TLS密度与DFS的相关性在大多数按年龄、性别、吸烟状况、肿瘤部位、分化程度和TNM分期分层的亚组中得到了进一步验证附加文件图S3和S4。
将TLS密度纳入TNM分期模型和临床模型后含有TLS密度的模型在三个数据集中的判别和校准能力比不含TLS密度的模型更好表3和图4C。
这些结果表明量化的TLS密度是预测可切除LUAD患者DFS的稳健生物标志物有望在临床上得到更广泛的应用。 根据肿瘤浸润淋巴细胞的空间分布肿瘤微环境可以被分类为三种免疫表型包括炎症型、免疫排斥型和免疫荒漠型。
在本研究中作者发现炎症免疫表型的患者倾向于有更好的预后而免疫荒漠表型的患者倾向于有更差的预后表2附加文件图S7。
近期研究显示不同的免疫表型可能对应于不同的抗肿瘤免疫反应。其中炎症表型通常伴随着强烈的炎症反应炎症肿瘤表现出更密集的免疫细胞浸润。肿瘤区域内TLSs的形成可能促进免疫反应的产生。
因此TLSs的存在或增加在LUAD的炎症表型中更为常见而在免疫排斥和免疫荒漠表型中TLSs的存在可能相对较少。这一关联与作者的发现一致p 0.001图4B。
此外计算机化的TLS密度在多变量分析中被识别为DFS的独立预后因素表2。相反免疫表型并未独立与可切除LUAD的DFS相关这可能表明量化的TLS密度具有提供更强预测力的潜在可能。
综上所述作者开发了一个自动化计算工作流程用于量化常规HE染色WSIs肿瘤区域中的TLSs并分析了TLS密度与可切除LUAD患者DFS之间的关系。
本研究表明量化的TLS密度是一个具有良好可靠性、可重复性和普遍适用性的独立预后生物标志物并且将TLS密度与临床病理学变量结合可以改善患者分层从而指导个性化的临床决策。 四、研究的局限性
本研究亦存在若干局限性。首先作为一项回顾性研究其固有局限性在于无法进行随机化设计。未来作者将进一步在更大的前瞻性队列中验证TLS密度的预后价值。
其次本研究是基于组织分割结果间接量化TLSs由于TLSs形态学的变异TLSs计数存在一定程度的偏差。尽管如此自动化TLSs计数与手动TLSs计数方法之间的一致性良好。
同时作者目前正在开发一个完全自动化的工作流程以直接在HE染色的WSIs上识别TLSs从而进一步提高TLSs计数的准确性。
此外作者还将根据TLSs的成熟程度将其分类为淋巴聚集物、初级滤泡和具有生发中心的次级滤泡并评估它们在可切除LUAD患者预后影响上的差异。 五、实验模型与研究对象细节
5-1患者
本研究是一项回顾性研究纳入了中国不同地区四家机构广东省人民医院GDPH、中南大学湘雅二医院XYSH、山西省肿瘤医院SXCH和云南省肿瘤医院YNCH的可切除肺腺癌LUAD患者。
研究时间跨度为GDPH2007年11月至2014年12月、XYSH2013年8月至2017年12月、SXCH2014年7月至2020年11月和YNCH2012年9月至2014年7月。
疾病无进展生存期DFS定义为从手术到复发或死亡的时间间隔被确定为感兴趣的研究终点。
作者从医疗信息系统收集了基线和临床病理学变量包括手术时的年龄、性别、吸烟状况、家族史、肿瘤部位、分化等级、TNM分期、VPI、LVI、手术类型、EGFR、ALK和辅助化疗。
排除了临床病理学变量缺失、接受新辅助治疗、剩余残留肿瘤R1/R2切除以及有其他恶性肿瘤病史的病例。 5-2组织切片数字化
作者从原发性肿瘤的HE染色诊断切片中获取了数字化全切片图像WSIs。HE染色的诊断切片在GDPH和YNCH使用Leica Aperio-AT2扫描仪美国0.252μm/像素、在XYSH使用Leica Aperio-GT450扫描仪美国0.264μm/像素、在SXCH使用Hamamatsu扫描仪日本0.220μm/像素以40倍放大率进行扫描。
此外作者还收集了GDPH中与本研究常规HE染色切片相邻的CD3染色的可用切片。这些免疫组化IHC染色的切片通过Leica Aperio-AT2扫描仪美国0.252μm/像素以40倍放大率进行数字化。
图像质量由一名经验丰富的病理学家B.B.L.在不了解患者临床信息的情况下进行审查并排除了模糊、含有伪影、染色不良或肿瘤组织不足的WSIs。 六、方法细节
6-1组织和细胞分割与分类
本研究概述如下所示。肿瘤区域的半自动分割采用与作者先前研究相同的策略。31
为了减少注释工作量作者使用迁移学习训练了一个ResNet5029模型进行肿瘤区域分割。作者从Camelyon1630数据集中提取了数百万个小型的正负图像块来预训练模型。
作者使用来自GDPH的67个注释的LUAD WSIs对预训练模型进行了微调。微调模型被用于来自四家医院的 所有WSIs的肿瘤区域分割。肿瘤区域的分割掩模由一名病理学家B.B.L.肉眼检查并手动校正了不完美的掩模见下图。
基于肿瘤区域分割的结果作者采用了基于块级分类标签的弱监督语义分割方法28来执行肿瘤区域内的组织分割最终减少了注释的工作量。该方法在10×放大倍数下将肿瘤区域分类为肿瘤上皮、肿瘤间质和淋巴细胞聚集。 此外作者部署了Hover-Net27在40×放大倍数下对肿瘤区域内的细胞进行分割和分类。
这些细胞被归类为肿瘤细胞、间质细胞、淋巴细胞和其他细胞。作者识别了淋巴细胞所在的组织区域并获得了癌上皮、间质和整个肿瘤区域内的淋巴细胞密度。23,32
然后作者使用淋巴细胞密度数据量化了三种免疫表型即炎症型、免疫排斥型和免疫荒漠型。24 6-2TLS密度量化
TLS密度的量化采用以下程序见组织和细胞分割与分类中的图。
首先作者计算了每个WSI的肿瘤区域面积。基于预先分割的组织分割掩模作者排除了直径小于150μm的淋巴聚集物13并获得了TLSs的最终分割掩模。
最后作者定义TLS密度为肿瘤区域内的TLS数量与整个肿瘤面积的比例如下所示 T L S 密度 肿瘤区域内的 T L S 数量 肿瘤区域面积 TLS密度 \frac{肿瘤区域内的TLS数量}{肿瘤区域面积} TLS密度肿瘤区域面积肿瘤区域内的TLS数量
为了对患者进行分层作者使用最大选择等级统计方法33在发现集中确定截止值。TLS密度低于截止值的患者属于TLS低组而TLS密度大于或等于截止值的患者属于TLS高组见组织和细胞分割与分类中的图。
为了分析手动计数与TLS自动计数之间的一致性作者从所有可用的组织病理学图像中随机选择了50个HE染色的WSIs和50个IHC染色的WSIs。
一名经验丰富的病理学家B.B.L.在不知道自动TLS分割结果的情况下手动识别了这些选定WSIs上的TLSs并确定了每个WSI肿瘤区域内的TLS计数。
本研究中的手动计数使用Aperio ImageScope版本12.3.2进行。使用ICC和Bland-Altman图来评估基于HE染色的WSIs或基于IHC染色的WSIs的手动TLS计数与作者的量化方法的自动TLS计数之间的协议。 6-3量化与统计分析
分类数据以计数百分比报告。三个数据集之间的差异通过Pearson卡方检验进行比较。中位随访时间通过逆Kaplan–Meier方法估计。使用对数秩检验来估计TLS低组和TLS高组之间DFS的差异。通过Wilcoxon秩和检验比较TLS高组和TLS低组肿瘤区域内淋巴细胞密度的分布。使用Cochran-Armitage趋势检验来分析TLS密度与免疫表型之间的关联。
使用Wald检验在单变量Cox回归分析中评估TLS密度和其他临床变量的预后能力。在单变量分析中达到统计学显著性P值小于0.05的变量被保留为后续多变量分析的候选变量。
基于AIC的多变量逐步Cox回归分析用于确定DFS的最优预测模型。预测模型的区分能力通过Harrell的C指数34和iAUC1000次引导重采样的AUC来衡量。模型的校准通过AIC来评估。
在5年DFS的预测准确性通过时间依赖的ROC和AUC曲线来衡量。使用LRT来确定模型间差异是否显著。此外为了进一步证明TLS密度是一个独立的预后因素还使用了不包括逐步回归的多变量分析来分析单变量分析中达到P0.05的所有变量。
所有统计分析使用R[36]软件版本4.1.2www.R-project.org进行使用的包包括survival, survminer, lmtest, risksetROC和vioplot。P0.05双尾被认为具有统计学意义。
