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分析前工作
爱基在进行数据分析之前#xff0c;会有两次质控报告反馈给老师们。第一个#xff0c;基因组DNA的提取质控…从样本准备到寄送公司每一天都在“祈祷”有个心仪的分析结果终于在这天随着邮件提示音的响起收到了分析结果......
分析前工作
爱基在进行数据分析之前会有两次质控报告反馈给老师们。第一个基因组DNA的提取质控报告图1保证DNA的完整性以及足够的量进行后续的富集亲和纯化第二个富集建库报告构建DNA文库利用磁珠富集与加完halo Tag标签表达的目的蛋白结合DNA片段并纯化获得IP文库。这个过程中为了检测蛋白表达的正常爱基利用抗体对富集产物进行 WB 检测同样对于文库也会进行质检图2。 图1 DNA提取质控报告 图2 WB结果显示目的蛋白表达正常
分析思路 第一部分
数据预处理去接头序列、污染序列、低质量碱基获得clean data序列并进行相关数据统计 第二部分
参考基因组比对将clean data定位到参考基因组上得到bam文件并去除重复序列保留唯一比对的序列 第三部分
call peak 将bam文件进行Peak检测得到富集区域的信息并进行Peak在基因功能元件的分布最近基因寻找及motif预测。 第四部分
Peak分析统计Peak分布情况对Peak最近基因进行GO、KEGG功能注释与富集及转录因子预测等。 图3 DAP分析流程
纵览整个本地分析结果peak和motif可谓是重中之重。爱基结果“03.peak”中包含了peak的长度统计、peak在功能元件分布饼图、peak在基因组上的分布情况是否有染色体偏好以及关键peak的reads分布图以上这些分析图也是在文献中普遍会见到的。而“06.motif”的结果则包含了大量潜在结合基序信息从中老师们可以筛选到心仪的验证位点。
如何筛选验证位点
1. 从基因角度出发
在“03.peak/01.peak_annotation”表格中记录着peak的详细信息包括在染色体上具体位置、长度、峰顶所在染色体的位置、显著性、富集倍数、落在某个基因的哪个位置、统计距离最近基因以及这些基因的在不同数据库的注释结果。 如果前期做过其它实验或者通过文献查找已经有了关注基因那么直接搜索基因id找到对应的peak通过获得的peak编号在“06.Motif”文件夹的ecxel表格中找到匹配Peak的motif就可以考虑验证啦~
如果没有做过上述调查可以现在基因注释列GO、KEGG、NR......搜索与自己课题相关的关键词。比如抗旱研究可以搜索活性氧、激素ABA、GA等。锁定到与研究内容相关的gene同行对应上peak再和上述方式一致根据peak找到motif。
总之这种方式逻辑是从gene→peak→motif。
2. 直接锁定基序
可以直接看motif网页版结果中的match Details有无基序在数据库中已经被收录匹配目标转录因子homerResults中看Best Match/DetailsKnownResults中看Name列。
以“sna/MA0086.2/Jaspar(0.681)”为例其含义是这个比对结果来自Jaspar数据库的sna转录因子MA0086.2是Jaspar的编号可通过这个具体编号找到对应sna-motif信息当没有MA编号时可以直接搜索转录因子的名称0.681代表该denovo motif与这个sna-motif的序列相似打分。如果研究的是sna就可以优先关注这个基序啦。
除此之外软件会自动按照显著性排序将更显著的排在前列碱基复杂程度低的、只有2个碱基不断重复的不建议优先考虑哦。 注Known和homer 是两种不同的motif预测算法结果都是可信的。Known motif基于已有转录因子数据库的motif结果比对本次的peak有没有在这些已有的研究motif上富集homer result是指利用所有的peak从头de novo计算得到motif然后会比对已有转录因子数据库的motif看比对率最一致的是哪个bestmatch。两者不一定一致因为motif序列是一组序列模式相似的序列可能会被归为同一个motif。
扩 展
通过上述的方式已经锁定了想要验证的基因位点后还需要确定下motif在基因/基因启动子区真实存在的碱基信息哦。参考【干货分享 | 一文GET寻找motif在序列上的定位】
想要更多了解欢迎各位老师前来咨询哦~
