黄页网站推广app免费下载,网站建设h5是指的那一块,adspower浏览器,杭州网站建设洛洛科技De novo production of protoberberine and benzophenanthridine alkaloids through metabolic engineering of yeast
将酵母代谢工程应用于原小檗碱和苯并啡啶类生物碱的从头合成
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原小檗碱生物碱和苯并啡啶类生物碱 (BZDAs) 是苄基异喹啉生物碱 (BIAs) 的子类后者是一类多样化的植物特有天然代谢产物具有多种药理活性。微生物生物合成使高价值的 BIAs 可以被更便捷地获取和规模化生产。在本研究中我们通过对酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 的代谢工程从头合成了一系列的原小檗碱和 BZDAs包括掌叶防己碱、小檗碱、白屈菜红碱、血根碱和 chelirubine。我们开发了一种内质网分隔策略以提高液泡蛋白小檗碱桥酶 (BBE) 的活性从而使关键中间体 (S)-金黄紫堇碱的产量增加了 200% 以上。另外我们还鉴定出一种多功能的液泡蛋白二氢苯并菲啶氧化酶 (DBOX)该酶能够在 N7-C8 位点对多种四氢原小檗碱和二氢苯并啡啶类生物碱进行双电子氧化。此外在胞质中表达的 DBOX 可以缓解对 BBE 的限制。本研究强调了通过异源植物酶的工程改造利用微生物细胞工厂合成多样化 BIAs 的潜力。
引言
抗生素在人体和畜牧业中的滥用已导致抗菌耐药性的出现对全球公共健康构成了严重威胁世界卫生组织在2015年强调了这一问题。作为一种替代方法具有抗菌特性的植物来源天然产物的探索已受到广泛关注。原小檗碱生物碱和苯并啡啶类生物碱BZDAs是此类天然产物中的两类由于它们对微生物和病毒的生物活性和安全性而受到越来越多的关注。原小檗碱和BZDAs均属于苄基异喹啉生物碱BIAs大家族该家族包括超过2500种结构多样的化合物以其药理特性著称。在该家族中小檗碱作为一种显著的原小檗碱生物碱因其对多种致病细菌和病毒的有效性而备受关注。此外许多关于小檗碱的临床试验正在进行以评估其药理特性包括降脂、抗糖尿病、抗炎及预防动脉粥样硬化的潜力。另一种显著的原小檗碱生物碱掌叶防己碱与小檗碱具有类似的抗氧化和抗炎特性并被认为是一种有前景的DNA光疗药物。关于BZDAs一个含有BZDA的著名产品Sangrovit®主要来源于血根草Macleaya cordata和Sanguinaria canadensis已被开发为一种安全的天然饲料添加剂在畜牧业和水产养殖中展现了改善生长性能和健康的益处。除了抗菌和促进动物生长的特性外许多BZDAs在医学上也显示出巨大的潜力。例如血根碱因其稳定人类端粒G-四链体DNA的能力而被认为是一种潜在的抗癌药物。白屈菜红碱是一种著名的蛋白激酶C抑制剂而红玉草碱对多种癌细胞系显示出抗增殖效果因此在各种应用中前景广阔。值得注意的是白屈菜红碱最近被报道为一种多用途的COVID-19治疗辅助剂。尽管这些化合物可以从植物中提取但通过大规模植物种植来满足不断增长的需求极具挑战性因此迫切需要替代方法即通过微生物生物合成实现这些产品的可靠和可扩展供应。微生物生产的关键在于提高酶的性能从而确保高效的生物催化过程。
在植物中原小檗碱和BZDAs生物合成的关键步骤是通过小檗碱桥酶BBE对S-牛心果碱(S)-RET到S-金黄紫堇碱(S)-SCO的立体选择性转化见图1。这种黄酶氧化酶已被确认为原小檗碱和BZDAs生物合成中的关键限速酶。然而在异源微生物宿主中提高BBE的催化效率具有挑战性这可能是由于植物和微生物之间微环境的差异。此前通过质粒或多次染色体整合增加BBE表达水平的尝试未能显著提高其在微生物宿主中的转化效率。体内分析表明BBE通过分泌途径表达并定位于植物液泡中这表明其活性依赖于翻译后修饰和运输过程。由于N端信号序列通常对于指导蛋白质进行此类处理步骤至关重要因此通过N端工程来改善植物酶的折叠或稳定性的常见策略对BBE优化不可行。事实上BBE的N端截短导致其在酵母中的活性降低。因此提高BBE在异源微生物宿主如酿酒酵母S. cerevisiae中的效率仍然具有挑战性。 为了使完整的代谢途径重建更为直观和易于理解该途径被划分为八个模块并以不同颜色高亮显示。模块I粉色从多巴胺和4-羟基苯乙酸4-HPAA的缩合开始生成第一个BIA化合物(S)-去甲乌药碱((S)-NOR)该化合物在模块II蓝色和模块III绿色中依次被转化为核心中间体(S)-牛心果碱((S)-RET)和(S)-金黄紫堇碱((S)-SCO)。模块IV天蓝色、模块V灰色、模块VI黄色和模块VIII橙色从分支中间体(S)-SCO分化分别旨在合成掌叶防己碱、小檗碱、血根碱和白屈菜红碱。模块VII玫瑰色则侧重于从血根碱扩展路径以合成 chelirubine。
原小檗碱和BZDAs生物合成的最后一步涉及额外的黄素蛋白包括(S)-四氢原小檗碱氧化酶(STOX)或二氢苯并菲啶氧化酶(DBOX)对四氢原小檗碱和二氢苯并菲啶的转化。尽管有关于四氢原小檗碱如(S)-四氢掌叶防己碱和二氢苯并菲啶如二氢血根碱的生产报道但酵母中从头生产原小檗碱和BZDAs如掌叶防己碱、白屈菜红碱和血根碱的研究仍然缺乏。一个主要的挑战在于最终催化黄素蛋白在酵母中的功能性表达。已有几种黄素酶被报道可在体外催化这种反应导致两电子形成一个双键或四电子氧化形成两个双键如AmSTOX、CjTHBO和PsFADOX5。然而这些酶在植物体内的活性尚未得到确认在酵母中也未观察到。最近血根草Macleaya cordata中BZDAs的生物合成途径得到了表征为原小檗碱和BZDAs的微生物生产提供了新的机会。
在本研究中我们开发了一个基于酵母的平台用于从头生产一系列的原小檗碱和BZDAs。我们首先构建了生产关键中间体(S)-SCO的平台菌株其产量通过一系列改进包括将液泡BBE重新定位到内质网、内质网扩展以及缓解内质网中H₂O₂毒性达到113 mg/L。基于这个(S)-SCO平台酵母我们扩展了该途径以生产多种原小檗碱和BZDAs包括脱氢金黄紫堇碱、哥伦布胺、掌叶防己碱、小檗碱、白屈菜红碱、血根碱和 chelirubine。特别地我们在酵母中功能性表达了来源于血根草的另一种液泡氧化酶McDBOX2该酶能够在体内去除两个电子以形成一个N7C8键。引入这种酶使得酵母中异源BZDAs途径的完整重建成为可能。然而由于McDBOX2在液泡中的表达会与BBE的翻译后处理产生竞争这一问题可以通过McDBOX2的胞质表达在一定程度上得到缓解。此外我们证明了McDBOX2可以催化多种四氢原小檗碱以生成相应的13,14-二氢原小檗碱。考虑到黄素酶催化的氧化是BIAs生物合成中常见的一步本研究中开发的策略为通用化工程改造酿酒酵母以从头生产更广泛的药用BIAs提供了见解。
结果
构建用于(S)-去甲乌药碱生产的平台菌株
在本研究中我们构建了酵母菌株用于从头生产原小檗碱和BZDAs如小檗碱、掌叶防己碱、白屈菜红碱、血根碱和 chelirubine。为简化重建过程整个生物合成途径被划分为八个模块如图1所示构建菌株的概览见补充图1和补充数据1。
为实现高效的(S)-去甲乌药碱((S)-NOR)生产我们首先集中选择一种最佳的酪氨酸羟化酶以合成多巴胺图2a。评估了几种已报道的能够催化酪氨酸羟化的候选酶包括来源于甜菜Beta vulgaris的CYP76AD1*和CYP76AD5拟南芥Arabidopsis thaliana和玉米Zea mays的C3H铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和鼠伤寒沙门氏菌Salmonella enterica的HpaB和HpaC。在这些酶中CYP76AD5的多巴胺产量至少比其他候选酶高出三倍补充图2a。接下来我们比较了几种候选去甲乌药碱合酶NCS以确定最适合(S)-NOR生物合成的酶包括来源于延胡索Corydalis yanhusuo的CyNCS12、罂粟Papaver somniferum的PsNCS3、人红罂粟Papaver bracteatum的PbNCS5、防己Stephania tetrandra的StNCS2和StNCS4、滇黄精Berberis thunbergii的BtNCS以及日本黄连Coptis japonica的CjNCS。已报道CjNCS的N端截短可以提高其表达水平因此我们分别截短了CjNCS的N端24、29和35个氨基酸生成CjNCS∆24、CjNCS∆29和CjNCS∆35。在多巴胺生产菌株XJ001中测试了所有这些NCS候选酶结果显示CjNCS∆35的(S)-NOR产量最高补充图2b。 从葡萄糖出发的生物合成途径在酵母中生成(S)-NOR。途径的颜色方案绿色内源基因或突变体的过表达橙色引入异源基因紫色箭头植物来源的酪氨酸途径黑色虚线箭头多个步骤红色基因缺失。EcAROL为香豆酸激酶MtPDH1为前苯酸脱氢酶AtPAT为前苯酸氨基转移酶MtncADH为非经典氨基酸脱氢酶PsAAAD*为芳香氨基酸脱羧酶突变体。PPP为磷酸戊糖途径E4P为赤藓糖-4-磷酸PEP为磷酸烯醇丙酮酸DAHP为3-脱氧-D-阿拉伯七碳糖酸-7-磷酸SA为香豆酸S3P为香豆酸-3-磷酸EPSP为5-烯酰丙酮酸-3-磷酸CHA为香豆酸PPA为前苯酸HPP为4-羟基苯丙酮酸4-HPAA为4-羟基苯乙醛Tyrosol为2-(4-羟基苯基)乙醇4-HPAC为4-羟基苯乙酸。经过去除潜在的醛还原酶或脱氢酶增加CjNCS∆35的拷贝数引入芳香氨基酸合酶和植物来源的酪氨酸途径工程化株系的(S)-NOR滴度和最终OD600被测定。至少培养了三株生物独立菌落在含20 g/L葡萄糖的20 mL最小培养基中生长72小时。增强通量表明酵母内源基因ARO1、ARO2、ARO3的过表达以及EcAROL、MtPDH1、ARO4K229L和ARO7G141S的表达。引入最优酶CYP76AD5、DODC和CjNCS∆35的(S)-NOR途径得到了改进。使用双尾t检验计算显著性。数据以平均值±标准差n3或4个生物独立样本表示。源数据作为源数据文件提供。
随后我们基于之前的研究构建了参考菌株XJ023通过增强酪氨酸生物合成的通量包括过表达酵母内源基因ARO1、ARO2、ARO3以及来自大肠杆菌的EcaroL、来自紫花苜蓿的MtPDH1和两个突变体Aro4K229L及Aro7G141S。通过将最优酶CYP76AD5、DODC和CjNCS∆35引入菌株XJ023得到的菌株XJ053产生了23.4 mg/L的(S)-NOR。然而在XJ053中也检测到大量多巴胺164.3 mg/L、4-羟基苯乙酸4-HPAC34.8 mg/L和酪醇281.7 mg/L补充图3表明大部分4-羟基苯乙醛4-HPAA的通量流向了副产物的形成。为了解决这个问题测试了三种不同的策略。第一种策略是将CjNCS∆35和Aro10编码苯丙酮酸脱羧酶或CjNCS∆35、Aro10和DODC封装在来自Myxococcus xanthus的细菌纳米腔室中。然而两种尝试均仅显示出与对照相比(S)-NOR生产的边际增加分别为6% p0.0117和13% p0.0002补充图4a–c。第二种策略采用过氧化物酶体的隔离。不出所料将CjNCS∆35或其与Aro10、DODC和CYP76AD5的组合靶向过氧化物酶体导致(S)-NOR生产在所有情况下显著下降补充图5。这与最近的报道相悖但可能归因于NCS表达水平、前体生产或菌株背景的差异。第三种策略是去除潜在的醛还原酶或脱氢酶对底物4-HPAA的竞争例如ARI1、ADH6、YPR1、YDR541C、AAD3、GRE2和HFD1。虽然破坏这七个基因在菌株XJ059中略微提高了(S)-NOR的生产但也导致了与未删除YDR541C和AAD3的菌株XJ058相比生物量产量下降了24%p0.0003图2b。为评估下游酶CjNCS∆35的表达水平是否有限选择菌株XJ058引入更多拷贝的CjNCS∆35。额外引入两个CjNCS∆35拷贝菌株XJ063使(S)-NOR的滴度提高至214.8 mg/L是菌株XJ058的2倍图2c。进一步整合更多拷贝并未提高(S)-NOR滴度补充图6a。有趣的是第二到第五个拷贝整合之间多巴胺、酪醇和4-HPAC的滴度保持在约100 mg/L补充图6b这表明可能在酵母中存在一些尚未特征化的醛还原酶或脱氢酶对4-HPAA的亲和力相对较高相比CjNCS∆35。
为了进一步提高4-HPAA的可用性我们使用芳香氨基酸脱羧酶AAAD将更多的通量引导至4-HPAA图2a。除了内源性Aro10之外比较了来自香芹PcAAS、红景天RrAAS和突变体PsAAADY350F来自罂粟的三种芳香氨基酸同源物在表达三拷贝CjNCS∆35的菌株XJ063中的效果。所有四种结果菌株的(S)-NOR产量均高于对照菌株XJ063其中包含PsAAAD的菌株XJ0633产量最高295.5 mg/L比菌株XJ063提高了38%p0.0001图2d和补充图7。
扩展酪氨酸生物合成重构的可能性我们进一步探索了酵母中的植物来源酪氨酸途径包括前苯酸氨基转移酶PAT和氨基酸脱氢酶ADH图2a和补充图8a。为此测试了三种PAT来自拟南芥的AtPAT、来自甜菜的BvPAT1和BvPAT2以及四种ADH来自甜菜的BvADHα、来自马利布尔斯·哈拉帕的MjADHα、来自紫花苜蓿的MtncADH和来自大豆的GmncADH在一个TYR1缺失菌株中该菌株表现出酪氨酸缺乏表型。显著的是五种PAT和ADH的组合AtPAT和BvADHα、AtPAT和MtncADH、BvPAT1和BvADHα、BvPAT1和MtncADH、BvPAT2和MtncADH恢复了TYR1缺失菌株的生长表明植物来源的酪氨酸途径在酵母中的功能补充图8b。然后在表达PsAAAD*的菌株XJ0633中评估这五种特定酶组合。BvPAT2和MtncADH的组合对(S)-NOR滴度产生了负面影响而其他四种组合则提高了(S)-NOR的滴度特别是AtPAT和MtncADH的组合显示出22%的增加p0.0156XJ0636315.9 mg/L与对照菌株XJ0633相比图2e和补充图8c。因此XJ0636被用作后续实验中的(S)-NOR生产平台菌株。
构建(S)-牛心果碱生产平台菌株
模块II专注于将(S)-NOR改造为下游的(S)-牛心果碱(S)-RET该过程由6-O-甲基转移酶6OMT、乌药碱N-甲基转移酶CNMT、N-甲基乌药碱3-羟化酶NMCH和4-O-甲基转移酶4’OMT依次催化图3a。为了确定前三个步骤的最佳酶组合测试了来自罂粟的Ps6OMT、PsCNMT来自加州罂粟的EcNMCH以及来自延胡索的替代Cy6OMT、CyCNMT和CyNMCH在一个简单的背景菌株XJ040中该菌株携带细胞色素P450还原酶和来自罂粟的4’OMTPsCPR和Ps4’OMT通过测量(S)-RET滴度。由Ps6OMT、PsCNMT和CyNMCH组成的组合导致了最高的(S)-RET产量CyNMCH的表现普遍优于EcNMCH而其他酶之间没有显著差异补充图9。当逆向顺序表达模块II酶的第二个拷贝时只有CyNMCH的过表达对(S)-RET滴度显示出显著增加补充图10这表明NMCH催化的羟基化是速率限制步骤。 模块II的示意图。P450 NMCH催化N-甲基乌药碱的羟基化速率限制步骤。CPR可以将两个电子转移至P450以进行催化。不同P450与CPR的最佳耦合提高了活性。(S)-RET滴度和工程菌株的最终OD600包含b各种NMCH和CPR的组合以及c多拷贝的速率限制酶。显著性使用双尾t检验计算。数据以平均值±标准差n4个生物独立样本表示。源数据作为源数据文件提供。
在真核生物中最常见的P450属于P450超家族的II类位于内质网膜上由两部分组成P450结构域和含有FAD/FMNH的NAD(P)H CPR结构域负责将电子转移给P450。为了提高CyNMCH的效率我们随后探索了不同细胞色素P450还原酶CPR的耦合以转移电子。除了PsCPR来自拟南芥的ATR1和ATR2也在(S)-NOR平台菌株XJ0636中与其他四种最佳酶Ps6OMT、PsCNMT、CyNMCH和Ps4’OMT比较用于(S)-RET的生物合成。与PsCPR222.3 mg/L相比ATR1273.6 mg/L和ATR2255.7 mg/L都提高了(S)-RET的滴度表明ATR1/2与CyNMCH的配对效果更佳图3b。然而在包含ATR1的最佳菌株XJ0675中观察到大量中间体3-羟基-N-甲基乌药碱和(S)-N-甲基乌药碱的积累补充图11。因此我们在菌株XJ0675中增加了CyNMCH和Ps4’OMT的拷贝数使用着陆垫系统进行精确的多拷贝基因整合。简言之载有单一外源gRNA切割位点的着陆垫在敲除五个基因ARI1、ADH6、YPR1、GRE2和HFD1时被插入。最终得到的菌株XJ0691携带2个Ps4’OMT拷贝和5个CyNMCH拷贝经过72小时在含20 g/L葡萄糖的摇瓶培养产生了425.2 mg/L的(S)-RET较对照菌株XJ0675提高了85%p0.0001图3c。
微调BBE以提高(S)-金黄紫堇碱滴度
在模块III中我们专注于BBE它催化(S)-RET的N-甲基部分氧化环化成(S)-金黄紫堇碱的小檗碱是原小檗碱和BZDAs生物合成的主要分支中间体。为了选择最佳酶比较了四种BBE包括来自罂粟的PsBBE、来自日本黄连的CjBBE、来自延胡索的CyBBE以及来自粉防己Stephania tetrandra S. Moore的StBBE在一个低(S)-RET产生的菌株XJ048中补充图12。除StBBE外表达所有候选酶均导致(S)-SCO的生产CyBBE表现出最高的活性。然而即使在表达CyBBE的菌株中剩余的(S)-RET量约为细胞中产生的(S)-SCO的两倍补充图12这表明(S)-RET的转化效率仍有进一步提高的潜力。 模块III的示意图关于微调BBE以提高(S)-金黄紫堇碱的生产。绿色菱形表示野生型CyBBE转运至液泡红色菱形表示保留在高尔基体的GOTS_CyBBE紫色菱形表示靶向内质网的CyBBE_ERTS回流至内质网。b显示CyBBE及其变体的荧光共定位(S)-SCO的滴度和工程菌株的最终OD600其中CyBBE被设计用于靶向不同的细胞器。比例尺表示5 µm。c展示了工程菌株获得的(S)-SCO滴度和最终OD600其中通过OPI1缺失扩展了内质网并表达了定位于内质网的mPRDX4以缓解H2O2产生引起的压力。显著性使用双尾t检验计算。数据以平均值±标准差n3或4个生物独立样本表示。源数据作为源数据文件提供。
先前的体外研究报告了BBE的最佳pH为8.9而体内实验揭示BBE含有内质网信号肽和液泡排序信号最终在植物中定位于液泡液泡的pH应为酸性。我们假设这种差异导致BBE活性低下。为了解决这个问题我们寻求将该酶重新靶向到不同的亚细胞区室。在酵母中线粒体基质的pH被报告为7.0-7.5细胞质和内质网的pH均约为7.0而高尔基网络的pH则从顺面高尔基到反面高尔基逐渐降低从6.5到6.0。为了在细胞质中表达CyBBE我们首先尝试了N端截短生成了两个变体CyBBE∆29和CyBBE∆46分别去除预测的内质网靶向信号或者同时去除内质网靶向信号和液泡排序信号。此外还构建了额外的截短变体CyBBE29Δ46通过删除液泡信号但保留内质网信号补充图13a和d。出乎意料的是所有三个CyBBE变体都未检测到(S)-SCO的生产补充图13b这表明这些截短影响了其正确表达或折叠。实际上荧光分析显示CyBBE∆29和CyBBE∆46在细胞质中表达但伴随严重的聚集形成而CyBBE29∆46可能由于幸存的内质网信号肽而进入运输途径补充说明1和补充图13f。此外Western blot显示野生型CyBBE和CyBBE29Δ46的带子大小大于CyBBEΔ29和CyBBEΔ46而后两者的表达如预期相似补充说明1和补充图13c。有趣的是经过PNGaseF处理后能够特异性去除N-连接糖基化野生型CyBBE和CyBBE29Δ46的大小转变不再观察到补充图13e。这些结果清楚地表明CyBBE经历了运输和翻译后修饰例如N-连接糖基化。
鉴于这两个信号对CyBBE的重要性我们转向将CyBBE从高尔基体回流至内质网或保留在高尔基体而不是将酶运输到原生的液泡目的地。我们设计了一个带有内质网C端HDEL肽的CyBBECyBBE_ERTS以模拟内质网腔可溶性蛋白或一个N端118氨基酸的高尔基靶向序列GOTS_CyBBE以模拟II型高尔基整合膜蛋白并在(S)-RET平台菌株XJ0691中测试这两个变体。GOTS_CyBBE和CyBBE_ERTS分别使(S)-SCO的产量提高了33%p0.0001和206%p0.0001与野生型CyBBE相比图4b和补充图15a。为了确定这两个变体和野生型CyBBE在酵母中的定位我们进行了绿色荧光蛋白GFP标记的这两个变体和野生型CyBBE的共定位显微镜分析并标记内质网、液泡和高尔基的红色荧光蛋白分别为Elo3、Vph1和Chs5。结果证实野生型CyBBE被转运至液泡GOTS_CyBBE在高尔基体中保留而CyBBE_ERTS被重新导回至内质网图4a和b。为了更好地理解ER回流策略的可能机制我们进行了RT-qPCR、Western blot、各种pH下的体外活性测定以及分子动力学模拟以比较CyBBE_ERTS和野生型CyBBE之间的差异补充说明2。虽然GOTS_CyBBE的表达显著增加CyBBE_ERTS的表达水平与野生型CyBBE相当补充图15b和c这表明(S)-SCO的产量增加了两倍以上是由于酶活性的提高而不是CyBBE_ERTS的表达水平。此外CyBBE_ERTS经过PNGaseF处理的Western blot显示出与野生型CyBBE类似的模式补充图15d这表明它们经历了相似的后修饰。此外体外测定确认较高的pH与内质网和液泡的环境相比确实有利于BBE催化反应的效率这与酶和底物水平提出的分子机制相匹配补充说明2和补充图16a–f。分子动力学模拟推测C端HDEL有利于CyBBE的稳定性补充图17a–f。因此这种内质网靶向策略确保CyBBE经过分泌途径进行适当的加工和翻译后修饰同时该策略也可以将其回流至内质网为其增加活性提供了更有利的微环境。
虽然CyBBE_ERTS将(S)-金黄紫堇碱的滴度提升至76.5 mg/L菌株XJ0695但仍有超过100 mg/L的底物(S)-RET残留补充图15a这表明这一步骤仍存在局限性。我们首先怀疑底物可用性是否是问题因为在细胞外检测到了(S)-RET。因此我们表达了来自罂粟(P. somniferum)的两个转运蛋白PsPUB1和PsBUP6以增强细胞外(S)-RET的再吸收效率。然而未观察到对(S)-SCO滴度的显著影响补充图18a。接下来我们尝试将Ps4’OMT空间性表达在靠近靶向内质网的CyBBE_ERTS通过与N端的内质网膜结合的CYB5融合CYB5-Ps4’OMT或通过N端的SPCyBBE和C端的ERTSSPCyBBE-Ps4’OMT_ERTS或者将两个酶的融合靶向内质网腔SPCyBBE-Ps4’OMT-CyBBE_ERTSCyBBE-Ps4’OMT_ERTS。直接融合导致(S)-SCO生产显著下降而CYB5-Ps4’OMT和SPCyBBE-Ps4’OMT_ERTS未影响(S)-SCO的生产补充图18b。这些结果表明底物可用性在当前阶段并不是限制因素。
其次我们怀疑剩余的过量底物(S)-RET可能是由于CyBBE_ERTS变体的低效。然而在菌株XJ0695中引入野生型CyBBE、GOTS_CyBBE或CyBBE_ERTS的额外拷贝导致(S)-SCO滴度的不同程度下降补充图18c这表明其他因素限制了这一步骤。
第三我们考虑了产品(S)-SCO和过氧化氢H2O2的潜在毒性因为两者已被证明会抑制BBE活性。由于(S)-SCO主要在细胞外检测到我们将注意力转向H2O2。我们通过与N端信号肽SPkar2和C端ERTS融合在菌株XJ0695中表达了定位于内质网的催化酶Ctt1、Cta1及一个Cta1突变体去除潜在的N-糖基化位点N241。所有候选者导致生长减缓并使(S)-SCO滴度下降约40%p0.0001补充图19a。我们没有在这些构建体上进行故障排除而是测试了一种基于哺乳动物的过氧化物酶IVPRDX4它具有N端信号序列和C端ERTSα-mPRDX4_ERTS可以将蛋白质氧化折叠产生的电子转移给H2O2从而生成水图4a和补充图19b。作为对照还生成了两个无功能突变体α-mPRDX4C127S_ERTS和α-mPRDX4C248S_ERTS通过突变任一活性位点的半胱氨酸。值得注意的是α-mPRDX4_ERTS的表达使(S)-SCO的滴度提高至98.4 mg/L比对照菌株XJ0695高30%p0.0028而两个突变体则导致(S)-SCO滴度下降补充图19b。这些结果确认H2O2的毒性是CyBBE_ERTS活性的潜在问题。
第四鉴于BBE是一个依赖FAD的氧化酶通过运输途径经历翻译后修饰我们考虑工程化运输途径作为优化CyBBE表达的替代方法1) 通过删除编码Mg2依赖的磷脂酸PA磷酸酯酶PAH1或负调控磷脂生物合成的转录调节因子OPI1或过表达编码磷脂生物合成转录激活因子的INO2INO2编码Opi1不敏感突变体Ino2L119A来扩展内质网2) 通过过表达切割后的HAC1、伴侣蛋白CPR5或删除激酶GCN2来改善蛋白质折叠3) 通过HRD1或DER1的缺失削弱与内质网相关的降解以最小化异常蛋白质向细胞质的逆转运并提供额外时间进行正确折叠或通过破坏液泡蛋白酶PEP4来减少蛋白质降解4) 通过过表达HDEL受体ERD1或ERD2来改善内质网中HDEL携带蛋白的保留从而缓解从分泌途径回收腔内ER蛋白的受体介导的饱和现象。在所有测试目标中只有过表达INO2、INO2和删除OPI1分别使(S)-SCO生产提高了17%p0.4225、18%p0.1726和36%p0.0022而过表达CPR5及删除HRD1、DER1则产生了相反的严重影响补充图19c。综上所述我们首先通过内质网分区策略改善了BBE活性并观察到OPI1缺失引起的内质网扩展导致(S)-RET转化额外提高了36%p0.0001进一步通过表达来源于哺乳动物的PRDX4减轻副产物H2O2的反馈抑制使(S)-RET转化增加了30%p0.0068。结合所有这些策略最终菌株XJ0843生产了113.1 mg/L的(S)-SCO代表了迄今为止报告的最高滴度图4c。
在酵母中进行原小檗碱的去新合成
在模块IV和V中我们旨在生物合成两种原小檗碱掌叶防己碱和小檗碱图1。掌叶防己碱的生物合成涉及从(S)-SCO出发的三个步骤由金黄紫堇碱 9-O-甲基转移酶S9OMT、非洲防己胺 O-甲基转移酶CoOMT和四氢原小檗碱氧化酶催化图5a和补充图20a。最初我们在基因背景简单的菌株XJ083中选择最优的甲基转移酶选项包括TfS9OMTThalictrum flavum、CjCoOMTC. japonica、ThCoOMTThalictrum thalictroides和CySOMTC. yanhusuo。显然双功能甲基转移酶CySOMT能直接将(S)-SCO转化为(S)-四氢掌叶防己碱((S)-THP)但将(S)-SCO转化为(S)-四氢非洲防己胺((S)-THC)的活性低于TfS9OMT在(S)-THP的生产上与CjCoOMT的活性相当补充图20b。随后我们将TfS9OMT和CySOMT分别与GOTS_CyBBE、CyBBE_ERTS或野生型CyBBE结合转化为(S)-RET生产平台菌株XJ0691。衍生的菌株XJ0839包含CyBBE_ERTS、TfS9OMT、CySOMT及OPI1的缺失产生了最高的(S)-THP达68.6 mg/L图5b和补充图20c和f。掌叶防己碱是通过失去四个电子的(S)-THP的氧化生成的。目前已报道一些植物来源的黄酮蛋白氧化酶在体外催化这种反应如STOX和DBOX候选酶但其在酵母中的异源功能尚未探索。我们优化了六个STOX同源体的密码子包括来自墨西哥蓝铃花的AmSTOX、来自威尔逊小檗的BwSTOX、来自日本杜鹃的CjTHBO、来自罂粟的PsFADOX5、来自心叶黄藤的McDBOX1和McDBOX2以及四个融合体HPA2-AmSTOXHPA2编码四聚体组蛋白乙酰转移酶、CySOMT-AmSTOX、HPA2-PsFADOX5、CySOMT-PsFADOX5转化至菌株XJ0700XJ0691CyBBE_ERTSTfS9OMT*CySOMT。所有生成的菌株和对照菌株XJ0700的掌叶防己碱生产量相似且较低这可能来自自发反应而非酶促反应补充图20d和e。然而我们观察到表达McDBOX1、McDBOX2和XJ0841的菌株XJ0727表达McDBOX1和XJ0728表达McDBOX2中(S)-THC和(S)-THP的生产水平明显下降相较于它们的对照菌株XJ0700或XJ0839补充图20e和f这表明在McDBOX1或McDBOX2的表达下从(S)-THC和(S)-THP中产生了一些未知化合物。对表达McDBOX2的菌株XJ0841的中间体分析通过LC-MS/MS显示出现了一个显著的m/z 354.16 [M]的峰该峰的保留时间26.93 min和商业标准的7,8-二氢掌叶防己碱27.32 min具有不同的串联质谱MS2但二者的m/z相同补充图21b–d。此外我们发现标准的7,8-二氢掌叶防己碱非常不稳定即使在最小培养基中也会在24小时内完全转化为掌叶防己碱而生产的化合物在摇瓶发酵中在144小时后仍然保持稳定补充图22a和b。先前的研究已确认STOX催化的四氢原小檗碱的氧化仅发生在其C环上而N7C14亚胺键的氧化产物不稳定迅速发生不等比例反应形成相应的四次元原小檗碱和四氢原小檗碱的混合物。因此我们推测(S)-THP通过在菌株XJ0841中表达McDBOX2被氧化为含有N7C8键的13,14-二氢掌叶防己碱补充图21a因为四次元掌叶防己碱的产量没有增加补充图20f。同样(S)-THC在该菌株中也被McDBOX2氧化转化为13,14-二氢非洲防己胺补充图21e和f而(S)-SCO在表达McDBOX2的菌株XJ0842中转化为13,14-二氢金黄紫堇碱补充图21g和h。最近有研究报告称加热增强了从四氢原小檗碱到相应的四次元原小檗碱的转化通过失去四个电子。我们因此测试了将菌株XJ0839的摇瓶发酵培养物在98°C下加热不同时间的效果。加热四小时后72%p0.0034的(S)-THP49.2 mg/L消失而产生了14.3 mg/L的掌叶防己碱补充图24a。加热时间增加到36小时后91%p0.0001的(S)-THP转化为54.0 mg/L的掌叶防己碱转化效率达到86%p0.0008图5c和补充图24a。 模块IV和模块V的示意图。b XJ0839和XJ0834中(S)-THP和(S)-四氢小檗碱的浓度。c 发酵液加热36小时后掌叶防己碱和小檗碱的浓度增加。显著性通过双尾t检验计算。数据以均值±标准差呈现n3生物独立样本。源数据作为源数据文件提供。
与此同时小檗碱的生物合成经历三个步骤从(S)-SCO开始由S9OMT、四氢小檗碱合成酶CAS和四氢原小檗碱氧化酶催化图5a和补充图23a。将TfS9OMT*和CjCASC. japonica引入菌株XJ0796XJ0695 ΔOPI1后得到的菌株XJ0834产生了23.2 mg/L的(S)-四氢小檗碱图5b和补充图23c。我们进一步尝试在菌株XJ0834中表达CjTHBO、ER靶向的CjTHBO_ERTS、Golgi靶向的GOTS_CjTHBO或McDBOX2。显然所有四种酶在提高小檗碱生产方面没有表现出活性补充图23b和c。只有在菌株XJ0835XJ0834 McDBOX2中表达McDBOX2才能将(S)-THC和(S)-四氢小檗碱分别转化为13,14-二氢非洲防己胺和13,14-二氢小檗碱补充图23d–f。此外我们还尝试通过在98°C下加热不同时间将(S)-四氢小檗碱转化为小檗碱。对菌株XJ0834的培养物加热四小时后87%p0.0001的(S)-四氢小檗碱被转化而小檗碱的生产量仅为3.9 mg/L。当加热时间延长到36小时后小檗碱的生产逐渐增加最终达到16.9 mg/L图5c和补充图24c。值得注意的是来自菌株XJ0841和XJ0835的13,14-二氢掌叶防己碱和13,14-二氢小檗碱在加热后也很容易被氧化补充图24b和d。此外经过四小时加热后还检测到了另外两种类型的原小檗碱去氢金黄紫堇碱和非洲防己胺补充图25a–f。
在酵母中进行苯并菲啶生物碱的去新合成
模块VI旨在扩展通路以从(S)-SCO生产血根碱依次由碎叶紫堇碱合成酶CFS、罂粟碱合成酶SPS、四氢原小檗碱 N-甲基转移酶TNMT、甲基罂粟碱 14-羟化酶MSH、原阿片碱 6-羟化酶P6H和DBOX催化图1。为了更方便地重建模块VI我们首先扩展下游通路以生产中间体原阿片碱补充图28a。来自E. californica和C. yanhusuo的两个酶候选物在(S)-SCO生产菌株XJ0695中与PsTNMT和PsMSH均来自P. somniferum共同表达。总离子色谱TIC和MS2分析证实生成了中间体原阿片碱EcCFS和EcSPS的酶组合表现出最佳活性补充图28b。先前的研究报告称酵母中从二氢血根碱中产生微量血根碱可能是自发转化或未知的酵母本地酶催化导致的。正如前面提到的这种反应可以由黄酮蛋白氧化酶催化。因此之前提到的六个STOX同源体AmSTOX、BwSTOX、CjTHBO、PsFADOX5、McDBOX1和McDBOX2与EcP6H来自E. californica一起转化至原阿片碱生产菌株XJ0743。蛋白凝胶电泳分析显示BwSTOX、McDBOX1和McDBOX2表达良好而PsFADOX5出现条带模糊AmSTOX和CjTHBO则未正常表达补充图29a和b。然而我们确实观察到所有转化体即使在对照菌株XJ07437仅表达EcP6H中也产生了血根碱这与之前在酵母中没有功能氧化酶催化的情况下低水平血根碱生产的观察一致补充图28c和e。令人惊讶的是表达McDBOX2的菌株XJ0750中二氢血根碱峰消失补充图28c推测McDBOX2在二氢血根碱转化为血根碱的过程中具有功能。通过引入McDBOX2结合EcP6H、McP6H或CyP6H所有衍生的菌株都能生产血根碱其中以EcP6H在菌株XJ0750中表现最佳补充图28d。
血根碱的下游衍生物chelirubine显示出对多种癌细胞系的抗增殖作用可以作为 DNA 荧光探针使用受到了越来越多的关注。该生物合成过程需要三种酶P450 羟化酶、O-甲基转移酶和黄素蛋白氧化酶将二氢血根碱转化为chelirubine如模块 VII图 1 和补充图 31a所示。我们首先在含有 McDBOX2 的血根碱生产菌株 XJ0822 中表达了来自加利福尼亚罂粟的三种 P450 酶 CYP82P2、CYP82P3 和 CYP82P4。在仅表达 CYP82P2 的菌株 XJ0851 中观察到与 m/z 348.09 [M] 对应的峰值补充图 31b 和 c这可能表明 CYP82P2 将二氢血根碱催化生成 10-羟基二氢血根碱然后通过 McDBOX2 催化氧化生成 10-羟基血根碱。随后我们在菌株 XJ0832 中联合表达了来自加利福尼亚罂粟的两个潜在的 O-甲基转移酶 Ec2OMT 和 Ec11OMT 与 CYP82P2。仅在表达 CYP82P2 和 Ec11OMT 的菌株中观察到 m/z 362.1 [M] 对应的峰值其 MS2 光谱与之前研究报告的chelirubine标准几乎一致补充图 31d 和 e。所有这些结果表明chelirubine在酵母中实现了从头合成。
同样我们通过在模块 VIII 中进一步引入 TfS9OMT、CAS、PsTNMT、PsMSH、EcP6H 和 McDBOX2图 1扩展了路径以从 (S)-SCO 生成白屈菜红碱。为了生产中间体 别隐品碱将来自日本黄连的 CjCAS 或来自延胡索的 CyCAS、TfS9OMT、PsTNMT 和 PsMSH 以染色体整合方式引入到 (S)-SCO 生产菌株 XJ0695 中补充图 32a。这两种酶组合均能够产生 别隐品碱而在菌株 XJ0741 中CjCAS 的活性较 CyCAS 在菌株 XJ0742 中的活性更高补充图 32b。通过联合引入 McDBOX2 和 EcP6H、McP6H 或 CyP6H所有产生的菌株均生成了白屈菜红碱其中 EcP6H 在菌株 XJ0747 中表现最佳补充图 32c。这些结果表明McDBOX2 具有广泛的底物范围能够催化白屈菜红碱、血根碱和chelirubine的生物合成。
优化 DBOX 表达以提高 BZDA 的产量
McDBOX2 可催化多种底物在 BZDA 生物合成中发挥关键作用图 6a。然而我们观察到 McDBOX2 的表达导致 OD600 降低并在白屈菜红碱生产菌株 XJ07411 和血根碱生产菌株 XJ07437 中 (S)-RET 积累增加图 6b。同样在 (S)-SCO 生产菌株 XJ0695 中表达 McDBOX2 时也发现了 (S)-SCO 产量减少和 (S)-RET 积累增加图 6b。这些结果表明 McDBOX2 表达在 BBE 活性方面存在某些限制这与我们预期不同因为 CyBBE 已被工程化定位于内质网而野生型 McDBOX2 假定位于液泡中图 4b, d。尽管它们未空间共定位但在酵母中表达的 CyBBE_ERTS 和 McDBOX2 具有三个共同特征包括都是依赖 FAD 的氧化酶、产生副产物 H₂O₂并经历从内质网到高尔基体的运输路径。由于 McDBOX2 产生的 H₂O₂ 位于液泡中可能不会影响定位于内质网的 CyBBE因此未考虑 H₂O₂ 生产的影响。接下来我们考虑 FAD 辅酶的竞争问题。我们尝试通过转入以下质粒以提高 FAD 可用性1携带 FAD 内质网定位的转运蛋白 FLC1、FLC2、FLC3 和 YPR365C2线粒体 FAD 转运蛋白 FLX13质膜转运蛋白 MCH54FAD 生物合成相关基因 FMN1 和 FAD15来自枯草芽孢杆菌的 BsRiba 和 BsRibc 到菌株 XJ0774补充图 34a。我们观察到表达 MCH5 或 BsRibc 的衍生菌株分别比表达空质粒的对照菌株在白屈菜红碱产量上提高了 24%p 0.0095和 39%p 0.0038而其他则对白屈菜红碱产量无显著影响补充图 34b。然而表达 MCH5、BsRibc 或空质粒的菌株中 (S)-RET 的产量基本一致补充图 34b表明 MCH5 或 BsRibc 的表达可能在此阶段提高了 McDBOX2 活性从而增加了白屈菜红碱的产量而不是缓解 CyBBE_ERTS 对 (S)-RET 转化为 (S)-SCO 的限制。接下来我们在菌株 XJ0819 中通过质粒过表达 SAR1 或将 SEC16 启动子替换为强启动子 GPD1p 或 TEF1p工程化了从内质网到高尔基体的 COPII 囊泡。过表达 SAR1 导致生长严重受阻和白屈菜红碱产量下降而 SEC16 启动子的替换则对白屈菜红碱的生产无显著影响补充图 35。 a 白屈菜红碱CHE和血根碱SAN生产策略的示意图。MCH5 是质膜结合的核黄素转运蛋白BsRibc 是来自枯草芽孢杆菌的 FAD 合成酶。橙色圆圈表示 FAD紫色六边形表示定位于内质网的 CyBBE_ERTS绿色和深绿色六边形分别表示定位于液泡的 McDBOX2 和胞质表达的 McDBOX2∆29。b 在工程化菌株中 McDBOX2 表达的代谢物浓度和最终 OD600 值。c 在表达 McDBOX2∆29、McDBOX2 或未表达 DBOX 候选基因的工程菌株中CHE 浓度和 OD600 的时间进程。实线表示 CHE 产量虚线表示 OD600。紫色代表不表达 DBOX 候选基因的菌株 XJ07411浅绿色表示表达野生型 McDBOX2 的菌株 XJ0747 (XJ07411 McDBOX2)深绿色表示表达 McDBOX2∆29 的菌株 XJ07472 (XJ07411 McDBOX2∆29)。d McDBOX2∆29 和 McDBOX2 在酵母中的荧光定位分析。比例尺代表 5 µm。e 工程化菌株 XJ07411、XJ0747 (XJ07411 McDBOX2) 和 XJ07472 (XJ07411 McDBOX2∆29) 中的 (S)-RET、CHE 浓度和 OD600。f 通过提高 FAD 可用性和 OPI1 删除介导的 ER 扩展来增加 CHE 产量。使用双尾 t 检验计算显著性。数据以均值 ± 标准差表示n 3 或 4 个生物独立样本。
尽管这种限制的机制尚不清楚我们通过改变 McDBOX2 的分隔位置来绕过该问题。由于大多数液泡蛋白在液泡中易被降解我们首先尝试将 McDBOX2 定位于内质网。蛋白凝胶电泳确认 McDBOX2_ERTS 在内质网中表达良好与野生型酶相同补充图 36a。然而定位于内质网的 McDBOX2 并未缓解问题因为 (S)-RET 的浓度和最终 OD600 与表达液泡定位 McDBOX2 的菌株相当甚至略微减少了白屈菜红碱和血根碱的产量补充图 36b。接着我们通过截短其 N 端 29 个氨基酸来测试胞质表达的 McDBOX2。蛋白凝胶电泳分析显示在表达 McDBOX2 截短蛋白的菌株中出现一个蛋白条带其大小接近理论值 56.8 kDa 的 McDBOX2∆29而野生型酶有多个条带补充图 36c。我们观察到胞质表达的 McDBOX2∆29 通过荧光标记验证显示出对细胞生长无抑制作用且 (S)-RET 浓度与未表达 McDBOX2 的菌株 XJ07411 相当图 6c–e。此外截短蛋白在菌株 XJ07472 (XJ07411 McDBOX2∆29) 中能够将所有二氢白屈菜红碱转化为白屈菜红碱但其产量略低于菌株 XJ0747 (XJ07411 McDBOX2) 在 40 小时生长后的水平可能是因为积累了更多的中间体 (S)-THC 和 (S)-顺式-N-甲基加南地定而非 McDBOX2∆29 的活性降低图 6c、e 和补充图 37a。同样地在菌株 XJ07502 (XJ07437 McDBOX2∆29) 中表达 McDBOX2∆29 使生长恢复减少了 (S)-RET 的积累将所有二氢血根碱转化为血根碱且产量高于对照菌株 XJ0750补充图 36d、e 和 b。这些结果表明 McDBOX2∆29 在一定程度上缓解了对 BBE 的限制。为了提高白屈菜红碱和血根碱的产量我们在同时表达 McDBOX2∆29 的菌株 XJ07472 和 XJ07502 中采用了上述策略。在我们的最终菌株 XJ07474 和 XJ07504 中通过结合核黄素转运蛋白 MCH5、FAD 合成酶 BsRibc 以及 OPI1 删除介导的 ER 扩展分别实现了 38.1 mg/L 的白屈菜红碱和 3.8 mg/L 的血根碱产量图 6f 和补充图 36f。此外通过 ACN 提取测量菌株 XJ0827 和 XJ0832 中的细胞内产品水平结果显示 9.6% (p 0.0008) 的白屈菜红碱和 22% (p 0.0001) 的血根碱积累在细胞沉淀中而其他中间体的细胞内含量低于 6% (p 0.0002)这表明相比最终产品白屈菜红碱和血根碱其他中间体更易于分泌到培养基中补充表 1。
讨论
在本研究中我们展示了在酵母中从头合成一系列的原小檗碱类化合物包括非洲防己胺、掌叶防己碱、小檗碱和 BZDA 类化合物例如血根碱、白屈菜红碱和chelirubine。起初我们构建了不同的生产平台菌株用于分别生产 (S)-NORXJ0636 315.9 mg/L、(S)-RETXJ0691 425.2 mg/L和 (S)-SCOXJ0843 113.1 mg/L通过组合多种策略如扩大酪氨酸池、减少不需要的 4-HPAA 分散、增加限速酶的拷贝、引入植物来源的酪氨酸合成途径和 4-HPAA 生物合成途径、CPR 配对、BBE 重定位、ER 扩展以及 PRDX4 介导的 H₂O₂ 降解。随后将 (S)-SCO 平台菌株进一步工程化以生产四氢原小檗碱类和二氢苯菲乙啶类生物碱这些可通过 FAD 依赖氧化酶 McDBOX2 转化为 13,14-二氢原小檗碱类和 BZDA 类化合物。同时我们观察到四氢原小檗碱类和 13,14-二氢原小檗碱类可通过加热或自发地转化为原小檗碱类而胞质表达的 McDBOX2 能缓解部分 CyBBE_ERTS 的活性限制。这些结果强调了酵母细胞工厂在药物开发中获取和扩大不同有价值的生物碱类产物的潜力。
新生的 BBE 蛋白通过分泌途径成熟最终定位于植物的液泡中。在本研究中我们确认 CyBBE 在酵母中成功表达并最终定位于液泡但其对 (S)-RET 的活性却相当低图 4b 和补充图 12a。此前试图通过多拷贝整合和 BBE 截短来提高 BBE 效率的尝试并未取得显著进展。最近的研究报道通过用来自酵母的液泡定位标签替换 THCAS 和 CBDAS 的 N 端信号肽并通过 N 端融合对 AbLS 进行工程化来改变其在反式高尔基网络 TGN 中的排序可以使这些植物来源的液泡蛋白在酵母中功能性表达。我们最初的尝试包括用液泡蛋白酶 A 的信号序列替换 CyBBE 的信号肽以及通过 N 端融合不同的可溶性结构域对 CyBBE 进行工程化均未显著提高 (S)-SCO 的产量补充图 14a 和 b。鉴于酵母中的每个亚细胞区室提供了独特的物理化学环境我们怀疑在酵母的不同区室如过氧化物酶体、ER、高尔基体和胞质中表达 CyBBE 是否会改善其活性。结果表明定位于过氧化物酶体的 CyBBE_ePTS1 的 (S)-SCO 产量与野生型 CyBBE 相当而胞质表达的 CyBBE 截短蛋白 CyBBE∆29 和 CyBBE∆46 几乎完全失去了活性表明将 CyBBE 引导至分泌途径对其正确表达或正确折叠至关重要补充注释 1。
关于酵母中的分泌途径它与植物共享大部分细胞器和翻译后修饰负责在这些细胞器中合成、折叠和传递多种细胞蛋白。在信号的引导下这些蛋白质首先进入 ER然后进一步运输到高尔基体以确保正确的折叠和修饰。之后一些蛋白质会返回 ER而其他蛋白质会停留在高尔基体或被运送到更后的区室如液泡和细胞外空间。例如具有液泡排序序列的蛋白质将从高尔基网络进入液泡包括本研究中的内源性 Pep4p 和 BBE。此外一些蛋白质先到达高尔基体的顺面结构后再返回 ER 以实现正常功能这些蛋白质包括 1携带 C 端序列 HDEL 的可溶性 ER 蛋白如 Kar2p2具有重要 C 端胞质基序的 I 型 ER 整合膜蛋白如 Wbp1p以及 3带有 N 端胞质 ER 保留信号的 II 型 ER 整合膜蛋白如 Mns1p 和 Alg5p。目前代谢工程中常用的 ER 定位策略是通过信号替换模拟 II 型整合膜 ER 蛋白正如一项将 CjSTOX 定位至 ER 的最新研究所示。在本研究中我们分别通过 N 端 Alg5p 信号肽替换构建了 II 型跨膜 ER 蛋白 SPALG5_CyBBE 和通过 C 端与 Wbp1p 最后 36 个氨基酸融合构建了 I 型跨膜 ER 蛋白 CyBBE_C36WBP1但两者几乎都丧失了对 (S)-SCO 的生产活性。值得注意的是通过 C 端 HDEL 融合模仿可溶性 ER 蛋白 CyBBE_ERTS我们验证了 ER 提供了一个更有利于 CyBBE 活性的环境。这种 ER 回溯策略通常适用于需要翻译后处理的异源酶表达。此外每个区室具有其独特的物理化学环境如 pH 值和氧化状态这可能为特定酶的功能提供有利条件。已知在酵母中液泡环境较酸性而 ER 的 pH 接近中性。我们的研究表明pH 值是使 ER 定位的 BBE 优于液泡定位的 BBE 的重要因素。因此这种 ER 回溯策略提供了一个更有利的微环境即 pH 值以最大化 BBE 的催化活性这对于需要特定 pH 条件的酶表达也适用。此外I 型整合膜蛋白的 C 端胞质尾部会导致其在高尔基体中停留例如 Kex1p 和 Kex2p而 N 端胞质区域包含芳香残基FXFXD的结构则对 II 型整合膜蛋白 Ste13p 的高尔基停留是必要且足够的。同样我们构建了一个人工 II 型跨膜高尔基蛋白 GOTS_CyBBE使得 (S)-SCO 的产量提高了 33%。这些结果表明ER 和高尔基体可能被用作异源途径代谢工程的有前景的细胞器。鉴于植物和酵母之间的微环境差异在重新定位特定的植物来源酶至酵母中的不同细胞器时考虑不同的策略是很重要的。
我们确认 McDBOX2 催化了酵母中 BZDA 生物合成的最后一步。由于 STOXs 的底物广泛性我们通过 LC-MS/MS 分析探索了 McDBOX2 对其他底物的功能并在菌株 XJ07438 (XJ0743 McDBOX2) 中观察到两个峰值分别对应 m/z 324.13 [M] 和 m/z 322.11 [M]可能是 (S)-蕨叶苷碱和 (S)-柄菊苷经两电子氧化生成的产物。结合 McDBOX2 催化生成 13,14-二氢小檗碱、13,14-二氢非洲防己胺、13,14-二氢掌叶防己碱和 13,14-二氢小檗碱的结果我们推测 McDBOX2 具有广泛的四氢原小檗碱类底物范围能够生成 13,14-二氢原小檗碱类。已知原小檗碱的裂解方式并非反式-Diels-Alder 裂解因其 C 环的不饱和结构这与本研究中生产的二氢原小檗碱类的 MS2 光谱大致一致。尽管我们已证实 McDBOX2 能催化四氢原小檗碱生成相应的 13,14-二氢原小檗碱但未能表达出能直接将四氢原小檗碱催化为原小檗碱的功能性 STOX。我们的结果表明四氢原小檗碱到相应的原小檗碱的催化可能是由两种酶连续完成的。这为筛选其他 STOXs 完成生物转化从而实现四级原小檗碱的生物生产提供了新的见解。
此外从菌株 XJ0743 的中间产物分析中显示分别对应于 m/z 342.18 [M]、340.16 [M] 和 338.14 [M] 的三个额外峰值被认为是由 PsTNMT 催化 (S)-SCO、(S)-蕨叶苷碱和 (S)-柄菊苷的 N-甲基化生成的产物补充图 33b–g。同样在菌株 XJ0741 中出现了对应于 m/z 354.18 [M] 和 m/z 356.19 [M] 的两个峰值可能来源于 (S)-小檗碱和 (S)-THC 经 PsTNMT 催化的 N-甲基化补充图 33h–k。这些发现提供了实验证据表明 PsTNMT 能够接受 (S)-SCO、(S)-蕨叶苷碱、(S)-柄菊苷、(S)-小檗碱和 (S)-THC 作为 N-甲基化的底物证实了 PsTNMT 的广泛底物范围。我们工程化的酵母菌株能够生物合成一系列的苄基异喹啉生物碱BIA化合物其中一些可能由于定位特异性的酶或潜在的转运蛋白参与生物合成过程而无法在植物中发现。
与多项关于在酵母中实现原小檗碱和 BZDA 生物合成最终氧化步骤的困难的报道不同最近的一项研究报道了在酿酒酵母中表达来自罂粟属植物的氧化酶 FADOX5 用于生产血根碱。然而在我们的研究中酵母中表达的该酶表现为涂抹式的表达且在菌株 XJ07434 中的血根碱产量与不含氧化酶候选基因的对照菌株 XJ07437 相当补充图 28c 和 e。此前已观察到无需 DBOX 酶表达即可生产血根碱这是由于酵母中的自发性或非专一性酶活性但其生产水平显著低于 McDBOX2 催化产生的水平补充图 28e。
在本研究中我们的 (S)-RET 平台菌株可用于放大生产其他多种天然 BIAs包括吗啡类家族的化合物。与液泡表达的 CyBBE 相比在 ER 内腔表达的 CyBBE_ERTS 在菌株 XJ0695 中使中间体 (S)-SCO 的浓度提高了 200% 以上p 0.0001展示了其作为高产抗癌药物诺卡品平台菌株的潜力。McDBOX2 的引入完成了 BZDA 合成途径的重建能够生物合成白屈菜红碱、血根碱和chelirubine其中白屈菜红碱在酵母中的浓度达到 38.1 mg/L。由于 McDBOX2 和 PsTNMT 的广泛底物特异性我们在工程化酵母中观察到多种 BIAs 的生产可用于探索它们的结构和药理活性。此外我们设想生产白屈菜红碱和chelirubine的最终菌株将有助于筛选下游途径酶以生物合成其他具有药理作用的 BZDA如白屈菜碱和macarpine。
方法
菌株和试剂
本研究中使用的所有菌株列于补充数据 1。大肠杆菌 DH5α 菌株用于常规质粒组装。所有酵母菌株均来自 IMX581 (MATa ura3-52 can1Δ:: cas9-natNT2 TRP1 LEU2 HIS3, CEN.PK113-5D)。
YPD 培养基由 20 g/L 蛋白胨Difco、10 g/L 酵母提取物Merck Millipore和 20 g/L 葡萄糖VWR组成用于常规酵母培养和制备感受态细胞。无尿嘧啶合成缺陷培养基SD-Ura由 6.7 g/L 不含氨基酸的酵母氮基底物Formedium、0.77 g/L 不含尿嘧啶的完全补充混合物CSM-URA, Formedium和 20 g/L 葡萄糖VWR组成用于筛选带有 URA3 标记质粒的阳性菌落。CSM 5-FOA 培养基包含 6.7 g/L 不含氨基酸的 YNB、0.79 g/L 完全补充混合物CSMFormedium和 0.8 g/L 5-氟乳清酸5-FOASigma用于回收 URA3 标记。必要时制备平板加入 20 g/L 琼脂Merck Millipore。Delft 培养基含有 7.5 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4 ⋅ 7H2O、20 g/L 葡萄糖、2 ml/L 微量金属溶液和 1 ml/L 维生素溶液如有需要补充 60 mg/L 尿嘧啶用于摇瓶发酵生产 BIAs。
Gibson 组装试剂盒和 Golden Gate 组装试剂盒由 NEB 提供。PrimeSTAR HS 聚合酶和 Phusion 聚合酶分别由 Takara 和 ThermoFisher 供应。供应的标准品包括盐酸多巴胺Sigma、(S)-牛心果碱Cymit Pamplona, 西班牙、4-羟基苯乙酸4-HP 酸TCI、4-羟基苯乙醇酪醇TCI。(S)-(-)-去甲乌药碱氢溴酸盐、(S)-地金茄碱、(-)-四氢非洲防己胺、白屈菜红碱氯化物和血根碱氯化物由 Toronto Research Chemicals加拿大多伦多供应。(S)-小檗碱和小檗碱由 Sigma 供应。7,8-二氢掌叶防己碱和 7,8-二氢小檗碱由 Yuanye中国上海提供。一些途径中间体由郭娟教授的实验室中国北京国家中药资源中心提供。
基因操作
本研究中使用的所有引物列于补充数据 2。IMX581 作为所有基因操作的起始菌株携带在 TEF1 启动子下染色体整合的 Cas9 基因。采用基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑方法进行染色体基因的删除、插入和启动子替换。使用 PrimeSTAR HS 或 Phusion 聚合酶从 IMX581 基因组 DNA 中扩增启动子和终止子。补充数据 3 中列出的异源基因由 GenScript 进行密码子优化合成。所有引物由 Eurofins 或 Integrated DNA Technologies 合成。对于基因删除设计了一个 120 碱基对bp长度的寡核苷酸其中分别有 60 bp 与目标基因的启动子和终止子同源。对于基因插入先用带有 5 端 30-40 bp 突出序列的引物扩增上游同源臂、启动子、基因、终止子和下游同源臂。整个修复片段通过重叠 PCR 组装。在插入两个或多个基因到同一位点且整个片段过长无法组装的情况下将修复片段分成几个部分进行构建。对于启动子替换从基因组 DNA 中扩增候选启动子并带有两端 50 bp 突出序列分别与目标启动子和目标基因的上游区域相同。对于 ER 定向 CyBBE 的盒设计我们用 GSGS 链接子将 C 端 HDEL 肽与 CyBBE 融合。具体而言我们首先用引物 XII-4 us-F 571/ XII-4 us-CCW12p-R 572、CCW12p1-F/ CCW12p-DODC-R1、CCW12p-CyBBE-F 573/ BBE1-ERTS-PGI1t-R 920、BBE1-ERTS-PGI1t-F 921/ XII-5-PGI1t-r-F 和 PGI1t-XII-4 ds-F 575/ XII-4 ds-R 576补充数据 2从酵母基因组 DNA 或合成的 CyBBE 序列中扩增 XII-4 上游同源臂、启动子 CCW12p、融合基因序列 CyBBE_ERTS、终止子 PGI1t 和 XII-4 下游同源臂。通过重叠 PCR 组装整个盒并与 pMEL10-XII-4-g RNA 质粒一起转化至相应的酵母菌株。本研究中使用的所有质粒列于补充数据 4。
为方便评估实验在某些情况下构建了 P416 质粒用于基因表达。简要来说使用 p416_GPD 质粒作为模板通过 PCR 扩增载体框架将候选基因和载体框架根据标准 Gibson 组装方法组装成完整的质粒。
对于 gRNA 质粒的构建采用 Gibson 组装或 Golden Gate 组装。首先使用开源工具 (CRISPRdirect) 对目标基因进行 gRNA 预测。pMEL10 作为基础质粒携带 SNR52 启动子和 gRNA 框架。对于包含一个 gRNA 的质粒首先通过 PCR 扩增使起始载体线性化。设计了两条反向互补的 60 bp 寡核苷酸每条寡核苷酸包含 20 bp 与 SNR52 启动子同源的片段、20 bp 的 gRNA 序列和 20 bp 与 gRNA 框架同源的片段由 Eurofins 合成。将寡核苷酸混合物在 95°C 下退火 10 分钟然后缓慢冷却至室温。将退火后的寡核苷酸混合物和线性化的载体组装成完整的质粒。对于包含两个或更多 gRNAs 的质粒首先通过 Gibson 组装构建只包含两个 BsaI 切割位点的宿主质粒 pMEL10-BsaI位于 SNR52 启动子和 gRNA 框架之间。简单来说通过 PCR 扩增将线性化的 pMEL10 分为两部分以移除抗生素标记氨苄青霉素序列中的一个 BsaI 位点。随后扩增出与酵母基因组不相关且两端各带一个 BsaI 位点的序列。将三个片段组装成宿主质粒 pMEL10-BsaI。常用的模板 gRNA-SNR52p 通过重叠 PCR 获得。基于此通用模板我们使用不同的引物扩增出插入片段 BsaI-N20(1)-gRNA-SNR52p-N20(2)-BsaI…… BsaI-N20(n-1)-gRNA-SNR52p-N20(n)-BsaI。这些插入片段和宿主质粒 pMEL10-BsaI 通过 Golden Gate 组装成含有一定数量 gRNAs 的目标质粒。所有质粒由 Eurofins 进行测序选择阳性质粒进行后续工作。高效酵母转化通过 LiAc/SS 载体 DNA/PEG 方法进行。
菌株培养和代谢物定量
将三个或更多生物独立的菌落接种到 1 mL 补充 60 mg/L 尿嘧啶的 delft 培养基中在 14 mL 培养管中以 30°C、220 rpm 培养 18-24 小时。然后将预培养物转移至 20 mL 新鲜的补充 60 mg/L 尿嘧啶的 delft 培养基中置于 125 mL 摇瓶中初始 OD600 为 0.05。除非另有说明培养 72 小时。对于携带 P416 质粒的菌株其培养过程与不含质粒的菌株相同只是使用未补充 60 mg/L 尿嘧啶的 delft 培养基。
发酵后的处理
发酵后测量 OD600 并从培养物中提取代谢物。简要来说将 500 µL 培养物与 500 µL 30% 乙腈ACN混合充分涡旋然后以 13000 g 离心 5 分钟。如有需要将上清液进一步用 15% ACN 稀释到适合 LC-MS/MS 分析的浓度。为了通过加热将四氢原小檗碱转化为相应的四级原小檗碱将培养物转移至 PCR 管在 PCR 仪中加热至 98°C。样品随后储存于 -20°C 直至分析。
每个样品取 1 µL 注入 LC-MS/MS 系统进行分析该系统由 Shimadzu Nexera UHPLC 系统和高端三重四极杆离子阱仪器Sciex QTRAP 6500与 Luna Omega 1.6 μm Polar C18 100 Å 柱Phenomenex组成。以 400 µL/min 的恒定流速进行洗脱溶剂 A 为 0.1% 甲酸水溶液溶剂 B 为含 0.1% 甲酸的 ACN。对酪醇、4-HPAC、多巴胺、(S)-NOR 和 (S)-RET 使用以下 MS 参数Curtain Gas (50)Collision Gas (中等)IonSpray 电压-4500 V4-HP 酸和酪醇、4500 V多巴胺、(S)-NOR 和 (S)-RET温度450°C。梯度方法如下0-4 分钟从 2% B 到 10% B4-6 分钟从 10% B 到 85% B6-7 分钟保持 85% B7-7.1 分钟从 85% B 到 2% B7.1-9 分钟保持 2% B。对于 (S)-SCO、模块 VI、VII 和 VIII 的中间体、白屈菜红碱和血根碱使用以下梯度方法0-0.1 分钟 10% B0.1-5 分钟从 10% B 到 45% B5-5.5 分钟从 45% B 到 90% B5.5-7 分钟保持 90% B7-7.01 分钟从 90% B 到 10% B7.01-9.5 分钟保持 10% B使用相同的柱子、流速和流动相。源参数设置如下Curtain Gas (30)Collision Gas (高)IonSpray 电压 (4500 V)温度 (600°C)Ion Source Gas 1 和 2 (60)。模块 IV 和 V 的化合物采用以下梯度方法0–0.1 分钟 10% B0.1–6.0 分钟从 10% B 到 25% B6.0–7.0 分钟从 25% B 到 70% B7.0–7.1 分钟从 70% B 到 98% B7.1-8.5 分钟保持 98% B8.5–8.6 分钟从 98% B 到 10% B8.6–10 分钟保持 10% B使用相同的柱子、流速和流动相。源参数设置如下Curtain Gas (40)Collision Gas (中等)IonSpray 电压 (3000 V)温度 (500°C)Ion Source Gas 1 (40) 和 2 (50)。对于分析物的定量使用 MRM 模式监测基于标准品的转换。对于分析物的鉴定使用 Q3 MI 模式或 MS2 模式补充表 2。数据采集和处理使用 Analyst 和 MultiQuant 3.0.3 软件。
未知化合物分析
使用 Waters Xevo G2-X QTOF 系统在正离子模式下进行电喷雾离子化源的未知化合物分析。扫描范围为 m/z 100-800扫描时间为 0.5 秒检测时间为 30 分钟低能冲击电压为 6 V高能冲击电压为 15-40 V。使用氮气作为溶剂气体亮氨酸脑啡肽作为实时校正。所有目标化合物均以 300 µL/min 的恒定流速洗脱使用 HSS T3 柱100 Å1.8 µm2.1 mm×100 mm溶剂 A 为 0.04% 甲酸水溶液溶剂 B 为含 0.04% 甲酸的甲醇。梯度方法如下0-5.0 分钟从 5% B 到 10% B5.0-20.0 分钟从 10% B 到 15% B20.0-23.0 分钟从 15% B 到 25% B23.0-26.0 分钟从 25% B 到 40% B26.0-27.0 分钟从 40% B 到 90% B27.0-28.5 分钟保持 90% B28.5-28.6 分钟从 90% B 到 5% B28.6-30 分钟保持 5% B。数据采集和处理使用 MassLnx 软件。
蛋白质印迹 (Western blot)
将菌株在 1 mL delft 培养基中以 30°C、220 rpm 过夜培养。然后将预培养物按 1:50 稀释转移至 5 mL 新鲜 delft 培养基中培养至 OD600 约为 1。收集 3 OD 的细胞用磷酸盐缓冲盐水PBS洗涤两次。加入 200 μL 酸洗玻璃珠和 300 μL 含有 1x 蛋白酶抑制剂混合物Sigma的 PBS 悬浮沉淀然后按照制造商说明使用 FastPrep 破碎细胞。为去除潜在的 N-连接寡糖将细胞裂解液在变性缓冲液0.5% SDS 和 40 mM DTT中处理 10 分钟于 98°C随后用胺酰酶 PNGase FThermoFisher在 37°C 下处理 1 小时。
加入 4 倍 NuPAGE™ LDS 样品缓冲液ThermoFisher的样品在 95°C 下煮沸 10 分钟。每个样品取 10 μL 加载到 4–20% Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ 蛋白胶Bio-Rad中以 150 V 电泳 1 小时。蛋白转移至 Trans-Blot® Turbo™ Mini PVDF 转移膜Bio-Rad并在含 5% 牛奶的 PBSTPBS 0.1% Tween 20中在室温下阻断 2 小时。膜用 PBST 洗涤三次每次 5 分钟并在室温下与 6x-His 标签单克隆抗体 (HIS.H8)ThermoFisher或抗 GAPDH 抗体 (G-9)Santa Cruz Biotechnology孵育 1 小时。膜用 PBST 洗涤三次每次 5 分钟并与 HRP 偶联的抗小鼠 IgG (H L) 二抗Invitrogen在室温下孵育 1 小时。膜用 PBST 洗涤三次每次 5 分钟并用 West Pico plus HRP 底物ThermoFisher孵育 5 分钟然后用 ChemiDoc XRS 图像分析仪Bio-Rad进行分析。
实时定量 PCR (RT-qPCR)
为了检测 CyBBE 及其两种变体的转录水平我们进行了 RT-qPCR。简要来说收集约 1 OD600 的细胞通过离心 12000 x g 提取 RNA使用 QIAGEN 的 RNeasy® 试剂盒按照制造商的协议进行操作。使用 QIAGEN 的 QuantiTect 逆转录试剂盒合成 cDNA。PCR 反应使用 DyNAmo Flash SYBR® Green qPCR 试剂盒Thermo Fisher Scientific在 Mx3005P qPCR 系统Agilent中进行。基因 ACT1 用作参考基因以标准化 RNA 水平。
体外活性测定
为了在不同 pH 条件下测试 CyBBE 和 CyBBE_ERTS 的体外活性我们按照 Western blot 的方法处理酵母细胞。随后用 100 mM tris-HCl 缓冲液pH 7.5在 20000 x g 下 4°C 离心 5 分钟清洗裂解物两次然后悬浮于不同 pH 值的柠檬酸-磷酸盐缓冲液或 tris-HCl 缓冲液中。加入标准品 (S)-牛心果碱 使最终浓度为 5 mg/L并在 37°C 下处理 2 小时。稀释后样品通过 LC-MS/MS 进行分析。
荧光显微镜分析
为了研究 CyBBE 和 McDBOX2 变体的定位将绿色荧光蛋白 (GFP) 融合到每个变体的 C 端并将编码内质网蛋白 Elo3、液泡蛋白 Vph1 和高尔基体蛋白 Chs5 的三个标记基因分别与 C 端的红色荧光蛋白 (mBuRy2) 融合。将相应的质粒详细信息见补充数据 1转化到野生型 IMX581 中。所得菌株在 delft 培养基中以 30°C、220 rpm 培养 18 小时。取 2 μL 细胞点涂到普通玻片上并用高分辨率共聚焦显微镜Carl Zeiss LSM 980 配有 Airyscan 2进行观察。为了检查在胶质小体encapsulin结构内多个荧光蛋白的共定位将两个分裂的 Venus 片段VN 和 VC和 miRFP670 与 C 端定位肽融合并引入表达壳蛋白 EncA 的菌株中。所得菌株在 delft 培养基中以 30°C、220 rpm 培养 18 小时。随后使用 LEICA DM2000 显微镜Leica Microsystems CMS GmbH对这些酵母细胞进行观察。
分子动力学模拟
首先使用 Alphafold2.2.3 构建 CyBBE、CyBBEGSGSHDEL 和 CyBBEGSGSVIML 的三维结构随后使用 UCSF Chimera 进行优化。蛋白质的原子电荷在 AMBER14SB 力场下计算质子化状态通过在线工具 H3 确定。小分子 (S)-牛心果碱 和辅因子 FAD 的结构从 PubChem 数据库获取。使用开源化学信息学软件包 RDKit 进行构象采样。构象在 MMFF94 力场下优化部分电荷通过 UCSF Chimera 使用 AM1-BCC 方法分配。
分子对接实验使用 AutoDock4.2 软件进行。使用 SiteMap 软件预测的最佳结合位点作为对接中心。对接中心的坐标设为 x 6.09y −0.12z −3.63。盒子大小设为 22.5 Å 的立方体间距步长设为 0.375。最大构象搜索限制设为 10,000。使用 Lamarckian 遗传算法 (LGA) 进行构象采样和评分。选择底物、辅因子和蛋白质的最佳复合体作为后续动力学模拟研究的初始模型。
使用开源软件包 GROMACS5.1.5 进行模拟。模拟系统设置在封闭环境中温度为 30°CpH 值为 5.5。所有系统的压力设为 1 bar。复合体在周期性边界条件下置于模拟系统的中心蛋白质边缘到盒子边缘的最小距离设为 0.1 nm。使用 pdb2gmx 将受体结构拓扑文件转换为 GROMACS 可识别的格式在 AMBEff14SB 力场下进行。使用 AmberTools 将小分子转换为 GROMACS 识别的拓扑文件并使用 GAFF 力场解析配体原子。加入 TIP3P 水分子以模拟水环境。采用最陡下降法对所有原子的系统能量进行最小化。在蛋白质位置受限的情况下分别在恒定粒子数、体积和温度 (NVT) 以及恒定粒子数、压力和温度 (NPT) 下进行 1000 ps 的平衡模拟。NVT 和 NPT 平衡后所有系统进行 50 ns 的生产动力学模拟每 2 fs 进行一次模拟。通过线性约束求解算法 (LINCS) 对共价键长度进行约束长程静电相互作用根据粒子网格 Ewald (PME) 方法处理。
统计分析
每次定量实验至少进行三次生物重复数值以均值 ± 标准差表示。通过 GraphPad Prism 8 使用非配对 t 检验评估对照菌株和衍生菌株之间的统计差异。在所有情况下p 值 0.05 被视为显著。* 表示 p 0.05* 表示 p 0.01** 表示 p 0.001。
