网站建设的网络公,wordpress跳过邮箱注册,网站不备案有什么后果,中信建设有限责任公司农业事业部在单细胞RNA测序过程中#xff0c;有时两个或多个细胞可能在制备过程中意外结合成一个单一的假细胞#xff0c;称为双峰细胞或双倍体。这些双峰细胞可能会扭曲数据分析和解释#xff0c;因此#xff0c;需要使用一些方法对它们进行识别和剔除。其中DoubletFind…在单细胞RNA测序过程中有时两个或多个细胞可能在制备过程中意外结合成一个单一的假细胞称为双峰细胞或双倍体。这些双峰细胞可能会扭曲数据分析和解释因此需要使用一些方法对它们进行识别和剔除。其中DoubletFinder是最常用的一个工具。
官方对DoubletFinder输入的对象和参数介绍 seu这是一个完全处理过的 Seurat 对象即已经完成了数据规范化NormalizeData、寻找变异基因FindVariableGenes、数据标准化ScaleData、主成分分析RunPCA和 t-SNE 分析RunTSNE。 PCs指定用于分析的统计显著的主成分数量例如 PCs 1:10。 pN定义生成的人工双倍体数量以合并的真实-人工数据比例表示。默认设置为 25%根据 McGinnis, Murrow 和 Gartner 在 2019 年的 Cell Systems 文章DoubletFinder 的表现在很大程度上与 pN 参数无关。 pK定义用于计算 pANN 的 PC 邻域大小同样以合并的真实-人工数据比例表示。没有默认值因为每个单细胞 RNA 测序数据集都应该调整 pK 值。最优的 pK 值应该使用下面描述的策略来估计。 nExp定义用于做出最终双倍体/单倍体预测的 pANN 阈值。这个值最好从 10X 或 Drop-Seq 设备的细胞加载密度中估计并根据同源双倍体的预估比例进行调整。
官网文档中对示例数据的要求和参数进行了解释。其中seu对象是建议提前进行处理的。PC值其实可以按照使用者降维聚类选择的值而定。pN就默认25%即可。pK和nExp有函数可以进行计算。
下面的表格是DoubletRate参数选择的参考文件(10X)在分析之前参照这个表格上边的细胞数选择DoubletRate值。 步骤流程
1、导入
scRNA是多样本已经合并完成并进行过标准流程后的数据集
rm(listls())
library(DoubletFinder)
library(BiocParallel)
library(qs)
library(Seurat)register(MulticoreParam(workers 4, progressbar TRUE))
scRNA - qread(./sce.qs)
table(scRNA$orig.ident)# check一下
DimPlot(scRNA,pt.size 0.8,group.by orig.ident,label F)2、DoubletFinder分析
一般是建议按照每个cluster进行分析SCT参数是指SCTransform如果是其他方式比如harmony之后的可以考虑不选择T。
#单个分开用来做DoubletFinder
sce_list - SplitObject(scRNA, split.by orig.ident)pc.num - 1:30
DoubletRate 0.023 # 大约4800的细胞
# 找到pK
sweep.res - paramSweep(sce_list[[C1]], PCs pc.num, sct F) # sct也可以选择T
sweep.stats - summarizeSweep(sweep.res, GT FALSE)
bcmvn - find.pK(sweep.stats)
pK_bcmvn - bcmvn$pK[which.max(bcmvn$BCmetric)] %% as.character() %% as.numeric()# 计算homotypic doublets的比例和预期的doublet数目
homotypic.prop - modelHomotypic(sce_list[[C1]]$seurat_clusters) # 最好提供celltype
nExp_poi - round(DoubletRate * ncol(sce_list[[C1]]))
nExp_poi.adj - round(nExp_poi * (1 - homotypic.prop))# 使用确定的参数鉴定doublets
sce_list[[C1]] - doubletFinder(sce_list[[C1]], PCs pc.num, pN 0.25, pK pK_bcmvn, nExp nExp_poi.adj, reuse.pANN F, sct F) # 也可以选择T# 图片展示
DimPlot(sce_list[[C1]], reduction umap, group.by DF.classifications_0.25_0.28_95)对sce_list中的每一个样本都需要走一遍流程之后再进行合并。 流程不复杂C1名称需要按照自己数据修改如果样本量多的话步骤会比较繁琐使用者可考虑进行函数封装。
同时也有一些观点认为应谨慎处理双细胞因为这些双细胞毕竟是人为定义的那么是不是真的是双细胞其实也是要思考的所以可以先进行双细胞的检测不删除等后续观察细胞分群的情况以及功能富集等一些操作之后再做考虑。
参考资料
1、DoubletFinder https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/DoubletFinder
2、单细胞天地https://mp.weixin.qq.com/s/O0U8vlMIG9vUVE3FK08LJg
致谢感谢曾老师以及生信技能树团队全体成员。
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